La Fertilización In Vitro es
la Técnica de Reproducción Asistida en donde la Maduración y Fecundación
de los gametos femeninos, así como el desarrollo de los
embriones resultantes hasta el estado de blastocisto se lleva
a cabo artificialmente a nivel de laboratorio, para con
posterioridad ser congelados o transferidos a una receptora en donde terminará
su período de gestación, dando lugar a un nuevo individuo viable.
Este
capítulo estará dirigido a presentar y analizar los diferentes aspectos
relacionados con la especie bovina, su aplicación, desarrollo y avances obtenidos a nivel nacional. En la
actualidad existe un gran número de Profesionales y Compañías de Reproducción
Asistida que ofrecen este servicio, algunas de las cuales han sido citadas en el primer capítulo del
presente Manual De Biotecnología Reproductiva En Bovinos.
La
primera cría en bovinos obtenida por FIV fue un ternero nacido el 9-06-1981. (BRACKETT)
Al
igual que la TE, la FIV se ha desarrollado desde el punto de vista
investigativo, requisito previo para su implementación y desarrollo a nivel
comercial, objetivo final como factor de producción, productividad y valor
agregado de la industria ganadera.
En
el aspecto investigativo la FIV permite obtener los conocimientos básicos para
entender el mismo proceso in vitro y poder afrontar otras líneas de
investigación como la criopreservación de gametos y embriones, la transferencia
nuclear y la producción de embriones genéticamente modificados. Igualmente
es posible la evaluación de la capacidad fecundante del
semen y el diseño de diferentes
protocolos de congelación y sexaje del mismo. Es una técnica que facilita la
conservación de especies en vías de extinción.
La
aplicación inicial de la Producción de Embriones In Vitro (PEIV) fue la obtención
de embriones bovinos a gran escala, a
partir de ovarios de donadoras de matadero. Como resultado de la implementación
de técnicas que permiten la recolección
de ovocitos de manera directa de ovarios
de donadoras vivas, se ha podido introducir ampliamente la PEIV en programas de
selección genética en las distintas especies.
La
utilización de la PEIV para la producción comercial de embriones presenta las
siguientes ventajas:
1.-
Logra un mejoramiento genético del hato más
ágil en un menor tiempo, acortando el período generacional, utilizando hembras de alta producción y reproductores probados.
2.-
Esta técnica no altera los ciclos reproductivos de la donadora, por lo que no hay necesidad de aplicar gonadotropinas,
evitando efectos secundarios por el empleo de FSH.
3.-
Se logra una mayor cantidad de embriones por donante ya que la aspiración
folicular puede realizarse a intervalos cortos. Igualmente puede
realizarse en hembras gestantes o poco
después del parto.
4.-
La FIV está indicada en hembras de alta producción que no son
aptas para un proceso de TE convencional, por deformaciones anatómicas que
impiden la fertilización y/o el lavado de
los embriones, como el cuello en S, o que no responden al tratamiento superovulatorio
MOET (Multiovulación y Transferencia de
Embriones). Así mismo está indicada en hembras que han sido eliminadas de la
reproducción por afecciones que no alteran el funcionamiento ovárico, como
metritis, complicaciones post quirúrgicas o lesiones podales, vacas repetidoras
(RODRIGUEZ)
5.-
La técnica permite la utilización de semen de toros costosos ya que el número
de embriones producidos por pajilla disminuye los costos del semen. Así una
pajilla es suficiente para 3 a 5 donadoras. De otra parte, cada grupo de ovocitos
se pueden inseminar con un toro diferente, lo que aumenta el número de posibles
combinaciones genéticas (MERTON)
6.-
La PEIV permite y facilita la utilización de semen sexado para la producción de hembras con
una eficiencia del 90%. (DAYAN)
Sin
embargo la FIV presenta algunos inconvenientes para el logro de resultados más satisfactorios.
1.-
A pesar de los esfuerzos realizados para mejorar la eficiencia de la FIV, esta
tiene aún un bajo rendimiento ya que el porcentaje de ovocitos capaces de
transformarse en embriones transferibles está entre el 30 – 40%.
2.-
Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los obtenidos in
vivo, existiendo entre ellos numerosas diferencias. Los embriones producidos in
vitro son más oscuros y de menor densidad por su mayor contenido citoplasmático
de lípidos. Tienen un menor número de blastómeras, en especial a nivel de la masa celular interna, una zona
pelúcida más frágil, reducción del espacio perivitelino y mayor velocidad de
desarrollo. Además presentan
alteraciones de comunicación intercelular, con una expresión anormal de las
proteínas que forman las uniones Gap, un mayor contenido de triglicéridos y
menor de otros lípidos, alteraciones de la expresión genética, mayor incidencia
de apoptosis.
Lo
anterior reduce su potencial de desarrollo pre y postimplantación, lo cual origina
bajos porcentajes de gestación (30-40%). (HERRADON)
3.- Existe una mayor divergencia
en el desarrollo embrionario de los obtenidos in vitro respecto de los in vivo,
ya que los segundos dependen del momento de la ovulación y la fecundación, sin embargo,
en el modelo in vitro el momento de la fecundación es más preciso y por lo
tanto tiene una mayor sincronización (PALMA)
4.-
Los embriones in vitro tienen menor resistencia a la criopreservación, siendo uno de sus principales
problemas, ya que la supervivencia después del congelamiento es menor que el de
los embriones producidos in vivo, lo cual dificulta su conservación a largo
plazo. Por lo tanto, estos embriones son transferidos preferiblemente en
fresco, lo cual requiere de la sincronización de las receptoras con la
producción de embriones. (COLAZO)
5.-
Nacimiento de terneros voluminosos, conocido como exceso de volumen fetal. Más
del 30% de los terneros nacidos por FIV presentan un peso superior a los 50
Kgs, independientemente de su raza. Lo cual aumenta el porcentaje de distocias
por este concepto. (KRUIP)
En
el Gráfico 1 se aprecia la tendencia de
la PEIV a nivel mundial.
Los TEs producidos por FIV en 2011 en Sur América fueron de
373.836, siendo el Brasil el país en
donde se logró el mayor número de TE-FIV 318.119, representando el 85% del total.
En Colombia se lograron
30.000 TE-FIV con un crecimiento del 900% en 10
Según
ASOCEBU durante 2012 se incrementó el Fertilizaciones In Vitro, para un total
de 4367. Para 2012, el incremento de la Transferencia de Embriones fue de un
3.52% frente a 2011, reportándose 4112 lavados al finalizar el año, de los
cuales 906 fueron embriones frescos, 3113 In Vitro y 93 congelados. (Revista
“El Cebu” 391 Marzo-Abril 2013)
En
la Tabla 2 se pueda apreciar cual ha
sido la Evolución de la TE-FIV en Colombia de 2.008 a
2.012 en donde se ha logrado un mejoramiento efectivo en el porcentaje
de preñez del 9.6% en 5
años. (GOMEZ)
TECNICA DE PRODUCCION DE EMBRIONES IN VITRO
- PEIV -
- PEIV -
La
PEIV es un método importante en el avance de áreas de investigación cuya
principal limitante es el alto costo de la producción convencional de embriones. Desde el punto de vista
comercial se emplea para acelerar la producción de animales genéticamente
superiores. Comprende para su realización
de los siguientes pasos:
1.- Recolección de ovocitos.
2.- Selección de ovocitos
3.- Transporte y Maduración
de ovocitos
4.- Capacitación
Espermática.
5.- Fertilización Gamética
6.- Selección de Embriones.
7.- Transplante de Embriones
RECOLECCION DE OVOCITOS
La
recolección de ovocitos puede realizarse a partir ovarios de hembras donadoras
de matadero o en donadoras vivas mediante procedimientos quirúrgicos,
laparoscopicos o Aspiración Folicular Transvaginal (OPU).
RECOLECCION DE DONADORAS DE MATADERO
La
obtención de ovarios de hembras de matadero es la forma más común y económica para la recolección de
ovocitos con fines experimentales en el proceso de FIV. Es el método que ha
permitido el desarrollo de la producción in vitro de embriones bovinos y la que
dio comienzo a la producción de embriones a gran escala.
Los
ovarios deben ser obtenidos enseguida del sangrado de los animales,
efectuándose un primer lavado con solución salina, para eliminar la sangre y
adherencias. El transporte puede hacerse en solución salina o PBS con
antibióticos a temperatura ambiente.
Yang
y col. Fueron los primeros en estudiar el tiempo de conservación de los ovarios
a 24-25°C. Los autores observaron que el transporte de los ovarios durante 11 horas no disminuyó la vitalidad de los
oocitos obtenidos, lo cual constituye un aspecto práctico importante al
permitir el procesamiento de material recolectado a grandes distancias.
Sin
embargo las temperaturas ambientales entre 30°C y 35°C alteran el tiempo de
procesamiento el cual debe hacerse dentro de las 2 horas de su obtención. Cuando
los ovarios se conservan durante 24 horas a 21°C, 18°C y 15°C los porcentajes
de división y de blastocistos no fueron diferentes del grupo a 25°C durante 4
horas. La refrigeración de los ovarios a 4°C durante 12 – 24 horas no afectó la
tasa de división. (PALMA)
Una
vez llegan los ovarios al laboratorio deben procesarse en condiciones asépticas
y bajo una cámara de flujo laminar. Se lavan 3 veces en medio de
transporte, se secan con gasa o papel
absorbente estéril, se depositan en
recipientes térmicos que contienen solución salina o PBS con antibióticos (Penicilina
G sódica 100 UI/ml + 100 g/ml de Sulfato de Estreptomicina) y se procede a la
obtención de los ovocitos para el proceso de FIV. (REA)
Se
efectúa mediante disección o cortes ováricos (slicing) o aspiración de los folículos.
TECNICA DE
DISECCION
La
técnica de disección tiene la ventaja de permitir el aislamiento individual de
los folículos determinando su tamaño antes de la recolección de todos los ovocitos,
con el fin de asegurar la máxima
recuperación de ovocitos competentes, de
cualquier donadora. (GALLI)
TECNICA DE
ASPIRACION FOLICULAR
La
técnica de aspiración de los folículos se realiza por medio de jeringas con
aguja N°18. Se introduce la aguja con el bisel hacia arriba dentro el estroma
ovárico, dirigiendo la punta hasta penetrar el interior del folículo, efectuando
enseguida la aspiración tanto del líquido folicular como del ovocito.
Al
efectuar la aspiración se aprecia la reducción de las paredes del folículo. Sin
retirar la aguja del ovario se busca un nuevo folículo para aspirarlo. Se aspiran folículos entre 2 a 6 mm de
diámetro. Los ovocitos de folículos bovinos con un diámetro menor se encuentran
todavía en fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad para
madurar. De otra parte los ovocitos provenientes de folículos de más de 10 mm
presentan un mayor número de ovocitos degenerados. (GONZALEZ)
Los
ovocitos aspirados son depositados en un tubo de ensayo, dejándolos en reposo
durante 30 minutos, en incubadora a 39°C, 5% de CO2 y 100% de humedad, con el
fin de favorecer la precipitación del sedimento compuesto por ovocitos, células
de descamación, sangre. Con posterioridad se aspira el sedimento con una pipeta
y se coloca en una caja de Petri con medio M-199L temperado, para la
correspondiente selección bajo el estereoscopio.
RECOLECCION DE
OVOCITOS EN ANIMALES
VIVOS
La
recolección de ovocitos en animales vivos se puede efectuar
mediante métodos quirúrgicos como ovariectomía transvaginal o paralumbar, laparotomía ventral o paralumbar, laparoscopia
abdominal, métodos invasivos y costosos que dejan secuelas como las
adherencias. Igualmente puede efectuarse la Aspiración Folicular Dirigida por Ecógrafo.
OVARIECTOMIA
La
ovariectomía puede efectuarse por vía transvaginal utilizando un bisturí de
Dutto y un dilatador vaginal. Se realiza una colpotomía dorsal del fornix
vaginal y se extraen ambos ovarios con el ovariotomo. (ALLER). Sin embargo el
riesgo de peritonitis y evisceración a través de la incisión vaginal han
limitado y restringido este procedimiento. Igualmente puede efectuarse por
laparotomía paralumbar y extracción con el ovariotomo, proceso similar a la
castración de hembras.
LAPAROSCOPIA
Se prepara la hembra mediante anestesia general y se localizan los puntos de penetración del equipo de laparoscopía, por
delante del tendón prepubico y por detrás del ombligo. Con la fuente de luz se
localizan los ovarios y se fijan alternativamente con la pinza caimán. Luego se
punciona y aspira el folículo por medio del aspirador conectado al tubo
recolector.
Por
lo general se somete la hembra a un
proceso de superovulación, con el fin de obtener un mayor número de ovocitos aptos, así como facilitar la
aspiración por el tamaño de los folículos. (DE LA FUENTE)
ASPIRACION
FOLICULAR TRANSVAGINAL - OPU -
Es
la técnica por medio de la cual se recolectan ovocitos de folículos en ovarios de hembras vivas, mediante
aspiración guiada por ecografía a través de la pared del fornix vaginal. Se
considera una adaptación de la técnica empleada en humanos. Es más conocida como Ovum Pick Up –OPU-
por sus siglas en ingles.
En
la actualidad es la técnica utilizada regularmente en el proceso de PEIV. La técnica de la OPU tiene la ventaja
de ser sencilla y adecuada, además de permitir
la recolección de ovocitos en series
repetidas para procedimientos in vitro, con un aumento en el número de
folículos luego de varias semanas de aspiración folicular.
La eficacia del
procedimiento de aspiración folicular transvaginal está directamente relacionada
con una metodología adecuada, dado que las variables técnicas para obtener los
ovocitos pueden tener un impacto considerable en la cantidad y la morfología
del cumulus oophorus (CCOs), y en consecuencia, sobre la capacidad para desarrollarse.
Otro aspecto se relaciona
con el tipo o raza de la donante, teniendo en cuenta su condición corporal y la
edad.
Es
de anotar que se observan variaciones de
tipo racial, encontrándose una peculiaridad del ganado Bos indicus en que las hembras suelen tener un mayor número de
folículos ováricos y ovocitos recuperados por OPU en comparación con el ganado Bos taurus. Esta información se ha
obtenido del ganado Nelore, responsable de aproximadamente del 80% del hato en
el Brasil. Sin embargo, no hay una explicación aparente para esta diferencia
biológica intrigante. (PONTES)
Hay
un constante incremento en la participación de las razas lecheras en el mercado
de embriones, especialmente el Gyr (68,0% del total) y Gyrholando (22,4%), la
única raza compuesta con una importante participación tanto en la TE como
en la PIV (VIANA).
El
interés por las razas cebuínas lecheras se debe a su capacidad de adaptación
para producir grandes cantidades de leche bajo condiciones de estrés tales como
altas temperaturas, parásitos y pastos pobres. El incremento del método de la
PIV en donantes Gyrholando se ha debido
al aumento de la eficiencia del uso de semen sexado para la fertilización in
vitro, lo que facilita la producción de un gran número de hembras para la
industria láctea. (XU)
En
la Figura se presenta
el comportamiento de
OPU en las diferentes razas
bovinas en Colombia, según GOMEZ.
Es
notorio y sin explicación alguna cómo
ciertas hembras han producido cientos de
ovocitos en un solo procedimiento OPU, sin ningún tipo de estímulo. SENEDA
obtuvo 251 ovocitos por una sola vez, al igual que otros profesionales, lo cual
indica la existencia de una variación individual en la producción de ovocitos
de donantes Bos indicus, en donde el
Nelore presenta una especial característica solo en la producción de embriones
in vitro. (RAFAGNIN)
Aunque las
hembras Nelore tengan
mayor número de
folículos reclutados, los
parámetros reproductivos pueden
variar ampliamente entre
los animales de
la misma raza, o incluso entre
gemelos monocigóticos. (MACHADO)
En la Figura se muestra los resultados obtenidos por el Dr Ramón Gomez, lo cual corrobora lo expuesto en tal sentido por otros autores.
Hay animales con un buen potencial para la OPU/PIV, debido a que presenta de forma natural muy altos promedios de ovocitos y por consiguiente buen número de embriones y preñeces. Muchos criadores han identificado hembras cuya progenie es muy buscada y fácilmente vendible, por lo tanto esas hembras se separan para PEIV.
En la Tabla 4 se puede observar el desenvolvimiento de la vaca 118/2
durante los años 2008-2012 en un
programa de PEIF. (GOMEZ)
En las hembras prepuberes
los ovocitos han demostrado una gran reducción de desarrollo al estado de
blastocisto debido a la poca influencia de las gonadotropinas en este período,
de otra parte las hembras viejas producen ovocitos con bajo porcentaje de
desarrollo y de baja calidad debido a las pocas capas de las células del cúmulo.
Puesto
que los ovarios de hembras gestantes mantienen su actividad durante la preñez,
es posible la recuperación de los ovocitos
hasta el día 100 de gestación o hasta el momento en que el profesional pueda
retraer los ovarios sin mayor esfuerzo. Igualmente está indicada en hembras de
alta producción con problemas
reproductivos no ováricos como alteraciones de tipo anatómico del tracto
reproductivo, afecciones podales y/o hembras repetidoras.
Por
lo anterior desde el punto de vista práctico y comercial, las hembras a aspirar
deben ser jóvenes, hijas de vacas de
alta producción o hembras adultas con registros actualizados, en su pico de
producción. De otra parte hay consenso
sobre la condición corporal (CC), en la que las donantes con baja CC
producen ovocitos con
menos capacidad para
desarrollarse al estado
de blastocisto, y además hay
evidencias de que
las donantes sometidas a
estrés tendrían ovocitos menos
competentes.
La
técnica de OPU es
un procedimiento mínimamente invasivo que
permite la recolección de ovocitos en sesiones repetidas a intervalos de 7 a 15
días, con lo cual se logra un mayor número de embriones por animal año, que por
TE convencional.
Existen
estudios que sugieren diferentes días del ciclo estral para realizar la OPU (días 3-4, 9-10, 15-16 después del
estro) y a diferentes intervalos de una o dos veces a la semana.
MERTON
et al sugiere que la mejor tasa de recuperación
se presenta cuando el intervalo entre punciones es de 7 días, al compararlo
con protocolos que utilizan intervalos de 3 o 4
días.
En
un trabajo realizado por MOREIRA y col,
se realizó la recolección de ovocitos mediante OPU a intervalos de una vez por
semana (Grupo 1) y dos veces a la semana (Grupo 2). No hubo diferencia
significativa entre los grupos G1 y G2. Los folículos >9 mm se observaron
durante todos los intervalos considerados entre aspiraciones (3-4 o 7 días). Se recolectaron más ovocitos por
sesión en el G1. La recolección de COCs Grado I fue mayor en el G2. No hubo
diferencia en la tasa de clivaje entre los grupos, pero el porcentaje de
embriones que alcanzaron el estado de blastocisto fue mayor en el G2. La mayor
calidad de los ovocitos del G2 fue compensada por la mayor tasa de recuperación
del G1.
GALLI
et al observaron que la OPU realizada dos veces a la semana, producía el mayor
número de ovocitos recolectados con
la calidad adecuada para la PIV.
La competencia de los
ovocitos obtenidos por aspiración folicular transvaginal no parece estar influenciada
por el tamaño del folículo, sin embargo se ha demostrado que la tasa de
recuperación es más alta significativamente para los folículos inferiores o
iguales a 4 mm. La tasa de recuperación es el número de
ovocitos recuperados tras la punción de 100 folículos y ha demostrado que los
folículos menores permiten la más eficiente recuperación ovocitaria
Como una estrategia para
mejorar la relación costo-beneficio en los programas de PIVE, los donantes
pueden clasificarse como adecuadas cuando la ecografía de los ovarios muestra
de manera satisfactoria la población de folículos con un diámetro superior a 3
mm (SENEDA).
Entre un 50 y 70% de los ovocitos obtenidos son aptos para fertilización In Vitro, alrededor del 90% de estos son fertilizados y entre el 20 y 40% alcanzan el estado de blastocisto. Por lo tanto, mantener una fuente constante de ovocitos de alta calidad de desarrollo, alto valor genético y máxima calidad sanitaria sería uno de los puntos claves para garantizar un sistema de producción de mebriones in vitro. (NAVA)
La tasa de preñez se
encuentra alrededor del 50% para los embriones en fresco y cerca del 40% para
embriones congelados, siendo la tasa de nacimientos menor en un 5-10% que la
tasa de preñez. Estos resultados ampliamente variables en los diferentes
programas de FIV. (WAGTENDONK-de LEEUW)
Algunos profesionales
han implementado la compra de ovocitos aspirados de novillas de matadero, provenientes de ganaderías de alta
producción, eliminadas con la finalidad de mantener la capacidad de carga de la explotación, las cuales se destinan
a la producción y congelación de embriones por FIV.
La
punción continua, dos veces a la semana, tiene una gran influencia sobre el
ciclo estral, al modificar la función endocrina y los mecanismos de crecimiento
folicular, lo que conduce a que se presenten intervalos irregulares o ausencia
de estros. Las punciones en sesiones frecuentes pueden dar lugar a una
disfunción o ausencia del CL y a una producción inadecuada de Progesterona. TAKENOUCHI et al sugieren que si la OPU
se limita a los días 0 y 12 del ciclo, la influencia de la dinámica folicular
puede disminuirse o eliminarse. BAGE
et
al afirman que en protocolo de dos veces a la semana, limitados a la primera
mitad del ciclo estral, en novillas,
estas presentan intervalos estrales normales. (PFEIFER)
Se
ha demostrado que la perforación del fornix vaginal cura rápidamente y solo en
pocas oportunidades se presentan inflamaciones o procesos infecciosos del
tracto genital. Puede desarrollarse en algunos casos hematomas en la región perivaginal, no siendo un
problema grave para la donante. La punción de los ovarios puede dar lugar a
fibrosis o adherencias, en especial en vacas sometidas a aspiraciones seriadas
en períodos cortos, igualmente se ha observado mineralización del folículo o
del parénquima ovárico, así como engrosamiento del epitelio ovárico, lo cual da
lugar a una disminución de la actividad ovárica. El riesgo de secuelas
consecutivas a la OPU existe y debe tenerse en cuenta, por lo que el procedimiento debe realizarse de
manera cuidadosa.
Por
lo anterior, al igual que en todas las técnicas de reproducción asistida, es
importante que el profesional tenga
bases firmes sobre anatomía y fisiología reproductiva, al igual que la
habilidad necesaria para la correcta
identificación del tracto genital y las estructuras funcionales del ovario,
tanto por palpación como por ecografía. Juega un papel muy importante el criterio y la
experiencia del profesional en la escogencia del protocolo a seguir teniendo en cuenta las
distintas variables tanto generales como individuales, al seleccionar la
donante y evaluar su capacidad de producción de
ovocitos, al momento de la OPU, para que se puedan lograr resultados
satisfactorios.
TECNICA OPU
Para
llevar a cabo la técnica de aspiración folicular in vivo se requiere
contar con un equipo de ecografía, un transductor sectorial, una bomba de
aspiración controlable y un sistema guía
de la aguja.
El
transductor lineal es sin duda el más utilizado en reproducción de animales
grandes. La principal desventaja de su utilización en OPU, se refiere al
limitado espacio entre el transductor y la aguja, lo que impide que todas las regiones del ovario sean
puncionadas, incluso para cambiar la posición de los ovarios.
En
la actualidad se utiliza el transductor
convexo o sectorial, por su versatilidad,
facilidad y eficiencia en la fijación
y el cambio de posición del ovario, así como una mejor apreciación de
folículos pequeños en comparación con el transductor lineal.
La sonda
ecográfica para OPU ha sido adaptada para permitir la fijación y manipulación
del ovario, de tal manera que este en contacto estrecho con el transductor y a
su vez permita que la punta de la aguja pueda visualizarse cuando penetra
dentro del folículo a ser aspirado.
Para
la aspiración se emplean agujas hipodérmicas desechables de calibre 18 - 19 y 40 - 50 mm de longitud. Las agujas con
calibres superiores a 18 están relacionadas con mayores tasas de recuperación,
pero con un porcentaje mayor de ovocitos desnudos, así como importantes daños
al estroma y una mayor cantidad de sangre en el líquido aspirado. Las agujas de
diámetro inferior a 18 han reducido las tasas de recuperación de ovocitos,
posiblemente por la lentitud de la aspiración del líquido folicular en el
momento de la punción.
Contrario
a las expectativas sobre que el bisel corto sería más eficiente, más fácil y
rápido de introducir en el interior del folículo, se ha reportado una mayor recuperación y calidad de los
ovocitos cuando se utilizaron agujas con bisel largo. La razón sería que el
corte del bisel largo permite una superficie más amplia de la
punta de la aguja lo que facilita la penetración dentro del folículo y evita la
posibilidad de fuga del contenido folicular.
(SENEDA)
La frecuencia del
transductor es una variable importante en el proceso de recolección de ovocitos
[26]. Hay citas de 3,5 MHz de frecuencia [8], de 7,5 MHz [27, 47], 5,0 MHz
[1,16,41] y 6,5 MHz [28,45].
En
primer lugar, al iniciar el trabajo, las hembras a utilizar deben sedarse con
xilazina y además recibir anestesia epidural con lidocaina al 2% (3-5 ml/vaca).
Luego se procede a limpiar y desinfectar
la vulva y el perine.
Se introduce
el transductor dentro de la
vagina, hasta el fornix vaginal, ubicando la cabeza del mismo en el lado del
ovario a puncionar. Luego se introduce la mano izquierda por el recto y se retrae
el ovario, fijándolo contra la cabeza del transductor.
Luego
de ubicar el ovario a aspirar, se impulsa la aguja suavemente para que penetre
la pared vaginal y luego la folicular.
Una vez
logrado esto la bomba de vacío aspira el contenido y lo deposita en el filtro
de embriones o en el recipiente destinado para tal fin. En cualquiera de los
casos estos deben contener medio de aspiración heparinizado (PBS+10% de suero
fetal bovino).
Luego
de completar la aspiración de los folículos en cada uno de los ovarios, los
ovocitos son depositados en un
recipiente y con posterioridad ser seleccionados para su consecuente
maduración.
SELECCION DE OVOCITOS
El
desarrollo in vitro de los ovocitos está íntimamente relacionado con la aptitud
que adquieren durante su etapa folicular previa, lo que se denomina maduración
ovocitaria. El folículo es una estructura ovárica con dos funciones, producción
de hormonas y de ovocitos aptos para ser fecundados. Las mismas son llevadas a
cabo por los folículos antrales, los cuales poseen una pared interna de células
de la granulosa que se apoyan sobre la membrana basal. Esta matriz extracelular
separa las capas epiteliales del mesénquima y afecta la migración celular, proliferación
y diferenciación de las células que se apoyan en ella.
La selección de los ovocitos se realiza generalmente en base a
tres criterios: el diámetro del ovocito, el aspecto de su citoplasma y las
características del cúmulo que los rodea. El diámetro de los ovocitos
condiciona su capacidad para madurar de
tal forma que los ovocitos bovinos con un diámetro inferior a 110 μm se
encuentran todavía en fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad
para madurar.
Los ovocitos rodeados por un cúmulo compacto formado por varias
capas de células, presentan mayores porcentajes de maduración, fecundación y desarrollo hasta blastocistos, que los que
carecen de cúmulo o los que están rodeados solamente por la corona radiata
Diversos autores han tratado
de establecer una relación entre el aspecto del citoplasma y la competencia del
ovocito para madurar, ser fecundado y soportar el desarrollo posterior. Así, se ha comprobado que los ovocitos que presentan un
ooplasma oscuro muestran una acumulación de lípidos y un buen potencial para el
desarrollo, mientras que los que presentan un citoplasma pálido tienen una baja
densidad de orgánulos y escaso potencial de desarrollo. Por otra parte, cuando
el ooplasma es negro, los ovocitos están envejecidos y tienen un potencial muy
bajo para soportar el desarrollo (Nagano et al., 2006) (HERRADON)
El
potencial de maduración, fecundación, capacidad de desarrollo embrionario de
los ovocitos se puede estimar por la aparición de células del complejo cumulus
oophorus (COC), con la siguiente clasificación.
Grado I
(GI) - Cumulus compacto, que contiene más
de tres capas de células. Ooplasma con granulaciones finas y homogéneas, que
llenan el interior de la zona pelúcida y
capa de color marrón.
Grado II (GII) - Cumulus compacto que rodea completamente
el ovocito, con menos de tres capas de células. Ooplasma con granulaciones
distribuidas heterogéneamente, que pueden estar más concentradas en el centro y
más claro en la periferia o condensadas en un solo lugar en donde se ve una
mancha oscura.
Grado III
(GIII) – Oopplasma contraído, con espacio entre la membrana
celular y la zona pelúcida, llenando el espacio perivitelino de manera
irregular. En este grupo se encuentran:
Desnudos - No
cubiertos por células del cúmulo o cubiertos en parte por ellas.
Degenerados –
Con ooplasma vacuolizado o fragmentado.
Atrésicos - Cumulus
oophorus oscuro o con presencia de signos de degeneración citoplásmica (RAFAGNIN)
MADURACION DE OVOCITOS MIV
Los
ovocitos una vez retirados de los
ovarios, no están aptos aún para ser
fecundados ey comenzar el desarrollo embrionario inicial, por lo que es necesario
que sufran una serie de modificaciones
estructurales y bioquímicas en el núcleo
–Maduración Nuclear- y
citoplasmática – Maduración Citoplasmática- para poder adquirir la capacidad de ser
fecundado, lo que en conjunto se denomina Maduración Ovocitaria.
La maduración del ovocito es la última
de una serie de etapas que debe atravesar una célula germinal femenina para
adquirir la capacidad de ser fecundada y dar origen a un nuevo individuo.
Durante esta última etapa el ovocito sufre profundos cambios a nivel nuclear y
citoplasmáticos que son regulados paracrinamente por una compleja comunicación
bidireccional con las células somáticas que lo rodean. Esta regulación local es
coordinada por factores endocrinos que son secretados en forma cíclica. Como
resultado de la interacción entre los diferentes niveles de regulación, paracrina
y endocrina, solo unos pocos ovocitos son seleccionados para iniciar la etapa
de maduración a lo largo de la vida fértil, mientras que la mayor parte
degeneran en atresia. Al final de la etapa de maduración ocurre la ovulación, y
el ovocito es, durante un corto período de tiempo, una célula completamente
competente capaz de dar origen a un nuevo individuo si es fecundada en un momento
determinado. (LATTANZI)
La
maduración nuclear y citoplasmática debe ocurrir simultáneamente confiriéndole
a los ovocitos la capacidad de ser
fecundados además de poder descondensar la cabeza del espermatozoide, formar
los pronúcleos y el desarrollo normal
del embrión.
Los
eventos nucleares consisten en la reorganización de la red de microtubulos,
rompimiento del envoltorio
nuclear, descondensación de los
cromosomas y progresión a la Metafase I, Anafase I, Telofase I, expulsión del
primer cuerpo polar y llegar al estado
de Metafase II.
En
cuanto al citoplasma, ocurre la
reprogramación de la síntesis proteica,
así como la activación de la proteinquinasa por los Mitógenos (MAPK) y el
Factor Promotor de la Maduración (MPF).
Igualmente se desencadenan los mecanismos de liberación de Ca++ y la adquisición de la capacidad de descondensar
la cabeza del espermatozoide.
Además durante este período ocurren
cambios en la reorganización del citoplasma
tales como el desarrollo continuo de los niveles lipídicos, reducción
del aparato de Golgi, aparición de los ribosomas adyacentes a los cromosomas, migración de las
mitocondrias y alineamiento de los gránulos corticales próximos a la membrana
plasmática. El aumento de los niveles lipídicos está asociado a la formación de
un pool de energético esencial para que el ovocito pueda
desarrollarse después de
la fecundación.
Otro evento que ocurre durante la maduración ovocitaria es la expansión de las
células del cúmulo que circundan al ovocito, las cuales son células
especializadas de la granulosa asociadas metabólicamente entre sí y con el
ovocito. Las proyecciones de las células del cúmulo atraviesan la Zona Pelúcida
y forman pequeñas uniones con el ovocito. Estas uniones son la única entrada de
sustancias que estimulan el plasma. En el ovocito inmaduro estas células están
muy compactas y durante la maduración se inicia la secreción de ácido
hialurónico, el cual se deposita entre
ellas separándolas y originando su
expansión.
La
expansión de las células del cumulo y la aparición de los cuerpos polares son
los síntomas más significativos de que la
maduración del ovocito sigue un
curso normal.
Existe una relación
entre el diámetro del folículo y el desarrollo del
ovocito y su capacidad de desarrollo in
vitro. Así ovocitos procedentes de folículos pequeños (1-2 mm) logran la
maduración nuclear pero son inmaduros citoplasmáticamente.
De otra parte ovocitos procedentes de folículos medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm) tienen un
mayor porcentaje de lograr la maduración nuclear y alcanzar el estado de
blastocisto. La competencia meiótica aparece cuando el ovocito alcanza el 80-90% de su tamaño,
pero hasta, que no alcanza su tamaño máximo
no puede completar la maduración citoplasmática.
La tasa
de maduración nuclear aumenta con el diámetro del ovocito, lo que sugiere que
los ovocitos con diámetro inferior a 110 µm están aún efectuando la síntesis de
ARN y por consiguiente todavía se encuentran en fase de crecimiento y por
consiguiente no han completado la maduración nuclear y citoplasmática en el momento de la FIV. Cuando
el diámetro ovocitario supera los 110 µm la mayoría de los ovocitos se
desarrollan hasta MII. (GONZALEZ)
Tabla 6
Se
aprecia la relación existente entre el tamaño del folículo y el ovocito y su capacidad para
alcanzar su desarrollo
a MII
Todos estos eventos que tienen lugar
normalmente en el animal, deben llevarse a cabo a nivel
de laboratorio durante el proceso
de Maduración IV.
Una
vez seleccionados los ovocitos son
colocados en un medio de
maduración e incubados a
38°C durante 24 horas en un
ambiente de alta humedad, 5% de CO2 y
protegidos de la luz. Una vez trascurridas
las 24 horas
de la MIV, los ovocitos
maduros (MII), están preparados
para su fecundación
MEDIOS DE
CULTIVO
Para
que se efectúen a nivel de
laboratorio las diferentes
etapas de maduración, desarrollo y fertilización
del ovocito, así como la evolución del embrión y su capacidad de ser
transferido, es necesario contar con
medios de cultivo celular adecuados, cuyos requerimientos fisiológicos para el
mantenimiento y desarrollo de los embriones son fundamentales y sus márgenes de
variación reducidos.
En
un principio los investigadores y profesionales de Asistencia Técnica Reproductiva, preparaban
sus propios medios de cultivo en laboratorios adecuados al respecto, lo cual
hace costoso y dispendioso los diferentes procedimientos.
En
la actualidad diferentes casas comerciales producen y distribuyen los medios
básicos de cultivo, los que pueden
restituirse poco antes de ser utilizados o ser refrigerados y almacenados por
periodos variables, según el caso. Estos medios contienen en general sustancias
como:
1.- Iones inorgánicos.-
Sus funciones son catalíticas y
fisiológicas.
2.- Fuentes de energía
como el lactato, piruvato y glucosa.
3.- Aminoácidos.- Intervienen
en la síntesis proteica, sirven como
fuente de energía, como tampones intracelulares del pH y regulación del
desarrollo embrionario.
4.- Vitaminas.- Juegan
un papel importante en el metabolismo de los hidratos de carbono y los
aminoácidos, como coenzimas.
5.- Elementos orgánicos
como fuente adicional de proteínas.
Suero Bovino (SB) - Albumina
Sérica Bovina (BAS)
Su
calidad y composición química depende del tipo y estado del donante, Suero
fetal Bovino (SFB), suero de ternero recién nacido, suero de novillo, suero de
vaca en celo (SVC).
Los
efectos benéficos de la adición del suero o la albúmina son:
·
Protección de las células reproductivas y embriones
en cultivo, de sustancias toxicas como los metales pesados.
·
Aportar
Hormonas y Factores de Crecimiento.
·
Reducción de la tensión superficial del
medio, evitando que los embriones se adhieran a los dispositivos como placas de
cultivo, pipetas, tubos etc. (MUCCI)
6.- Hormonas.- Las hormonas inciden notoriamente en el
desarrollo embrionario, siendo benéficas sobre el complejo cúmulo-ovocito completando la maduración
meiótica. Diversos autores han adicionado hormonas como LH, FSH y 17β Estradiol
a los medios de maduración y desarrollo de los ovocitos, con el fin de lograr un mayor número de
embriones transferibles. Recientemente
se ha empleado como sustitutos de ellas el Líquido Folicular (LFb) y el Fluido
Oviductal Sintético modificado (SOFm). El LFb contiene esteroides,
glucosaminoglicanos y metabolitos sintetizados por las células de la teca
folicular.
7.- Antibióticos y Antimicóticos.
Simultáneamente los medios de cultivo son complementados con antibióticos y antimicóticos, con el fin de suprimir el
crecimiento de microorganismos contaminantes.
Otros
requisitos del medio de cultivo están relacionados con:
Agua =
Se emplea como diluyente de los componentes del medio, recomendándose la
utilización de agua Bidestilada (BD) o tridestilada. Actualmente se emplea el sistema de
purificación mediante osmosis reversa. Su grado de pureza está fuertemente
relacionada con el desarrollo embrionario.
pH
= El pH debe estar entre 7.2 y 7.4 para
cultivo, mientras que para el medio de fecundación se recomienda un pH superior
7.6 – 7.8.
Osmolaridad
= La osmolaridad óptima en el medio de
cultivo debe estar entre 275 y 285 mOsm.
Dióxido de carbono (CO2)
y tensión de Oxígeno (O2) = Las condiciones habituales para la maduración
y fertilización del ovocito son 5% de CO2 y 95% de aire. El CO2 es necesario
para la regulación del pH intracelular. Para el desarrollo embrionario CO2 5%, O 5%, N 90%
Temperatura = La
temperatura de cultivo utilizada en general por los investigadores es de 38.5°C
con 100% de humedad.
Conservación =
Almacenamiento en refrigeración entre 2 – 6°C
Signos de alteración =
Cambios de coloración
Presencia de grumos o precipitado
Insolubilidad
SOLUCIONES BASICAS
Estas
soluciones permiten la adición de diferentes sustancias de acuerdo a las
distintas etapas del proceso de FIV, así
como las indicaciones de los
investigadores, con el fin de lograr mejores porcentajes de fertilización,
teniendo en cuenta los resultados
obtenidos en sus trabajos.
Las
soluciones que se utilizan en las técnicas de reproducción asistida.se
denominan Soluciones Madre. Las alícuotas se depositan en una gradilla de
poliestireno plástico y se etiquetan con
el número de solución madre, nombre de la solución, volumen de la alícuota, y
fecha. La selección del agua para hacer soluciones madre depende de la
disponibilidad de agua altamente purificada. Para la preparación de estas
soluciones se puede adquirir agua
especial de laboratorios (e.g., Sigma) para cultivo de tejidos. Para los otros
medios (MCO, salino) se puede utilizar agua destilada o desionizada.
A
continuación se listan las soluciones madre que se pueden preparar de acuerdo con el MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIO (RIVAS)
Solución
Madre 1: Lactato de Sodio.
Hay que
comprarlo como almíbar al 60%.
Vea las
indicaciones del fabricante para la fecha de
vencimiento.
Almacenar a 4°C.
Solución
Madre 2: Piruvato de sodio.
Disolver 0.220
g de Piruvato de sodio en 100 ml de agua.
Filtre
estérilmente dentro de un recipiente (Frasco) de 100 ml
cubierto con
papel aluminio
Almacenar a 4°C por un máximo de 2 meses.
Solución
Madre 3: Suero de novillo bovino (BSS, por sus siglas en inglés).
Preparar alícuotas de 10 ml de BSS en
tubos estériles de 13 ml y
almacenar a -20°C indefinidamente.
Solución
Madre 4: Suero de novillo bovino/Heparina (BSS/Hep).
Adicionar 1000
unidades USP de heparina estéril (disolver en
3 a 5 ml de
agua y
Esterilizar a
través de un filtro con una jeringa) en 500 ml de
BSS
(Solución
Madre 3).
Almacenar en
alícuotas de 8 ml en tubos estériles de 13 ml
indefinidamente
a -20°C.
Solución
Madre 5: Estradiol.
Disolver de 1
a 3 mg de estradiol en etanol para una
concentración final de 1
mg/ml.
Almacenar en
un contenedor de vidrio a - 20°C hasta por 2
meses.
Solución
Madre 6: Hormona Folículo Estimulante (FSH, por sus siglas en inglés).
Reconstituir
la hormona FSH que sea altamente purificada de
Glándulas pituitarias
porcinas (Folltropin), como lo
recomienda el
fabricante.
Colocar
alícuotas de 150 μl en tubos de microcentrífuga
estériles de
1.5 ml.
Almacenar indefinidamente a -20°C.
Solución
Madre 7: Heparina.
Disolver 20 mg de Heparina en 10 ml de agua.
Depositar
alícuotas de 300 μl.
Almacenar a
-20°C en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml
indefinidamente.
Solución Madre 8: Gentamicina.
Diluir a una
concentración de 5 mg/ml con agua y filtro
estéril.
Depositar alícuotas de
1 ml dentro de tubos estériles de 4ml.
Almacenar a
-20°C indefinidamente.
Solución
Madre 8A: Gentamicina.
Al preparar
la solución madre 8, prepare unos pocos de
tubos extras
con alícuotas de 10 μl en tubos de
microcentrífuga
estériles.
Almacenar a
-20°C indefinidamente.
Solución
Madre 9: Mezcla PHE.
Prepare
soluciones madres primarias de:
Hipotaurina 1 mM (1.09 mg/10 ml
de solución salina).
Penicilina 2 mM (3 mg/10 ml de
solución salina).
Epinefrina 250 mM
(1.83 mg/ 40 ml de la siguiente
solución:165
mg almíbar al 60% de lactato de sodio,
50 mg
metabisulfito de sodio y 50 ml de agua).
La
epinefrina se oxida fácilmente por acción directa de la luz, por lo que hay que
tomar precauciones para evitar este problema (envolver en papel aluminio o
colocar en un recipiente oscuro o ámbar).
Combinar
5 ml de la solución con 1 mM de hipotaurina, 5 ml de la solución con 2 mM de
penicilamina, 2 ml de la solución con 250 mM de epinefrina y 8 ml de solución
salina, y filtre estérilmente.
Preparar alícuotas
de 400 ml de PHE mezclado dentro de tubos de microcentrífuga estériles
de 1.5 ml y almacene en un contenedor resistente a luz a -20°C indefinidamente.
Al utilizar
la mezcla PHE cubra los tubos con papel aluminio.
Solución
Madre 10: Glutamina (1ml).
Preparar una
solución madre de 1.5 g de glutamina/100
ml de
agua.
Filtrar
estérilmente.
Depositar alícuotas de 1 ml en tubos estériles de 4 ml.
Almacenar a
-20°C indefinidamente.
Solución
Madre 11: Glutamina (4 ml).
Preparar
una solución madre de 1.5 g de glutamina/100 ml
de agua.
Filtrar
estérilmente.
Hacer alícuotas de 4 ml en tubos estériles de
13 ml.
Almacenar a -20°C indefinidamente.
Solución
Madre 12: Cloruro de Magnesio (MgCl2) para Percol.
Preparar una solución Madre de 0.1 M, añadiendo 0.203 g
de MgCl2 a
10 ml de
agua.
Filtrar
estérilmente}
Almacenar a
4°C indefinidamente.
Solución
Madre 13: Cloruro de calcio (CaCl2) para Percol.
Preparar
una solución Madre de 1 M, añadiendo 0.735 g de
CaCl2+2H2O
a 5 ml de agua.
Filtrar estérilmente.
Almacenar a
4°C indefinidamente.
Solución
Madre 14: Hialuronidasa.
Preparar
una solución Madre de Hialuronidasa tipo IV
10
mg/ml de solución salina (aproximadamente 8000 U/ml).
Almacenar
alícuotas de 1.2 ml a -20°C indefinidamente
.
Solución
Madre 15: Penicilina/Estreptomicina (Pen/Estrep 4 ml).
Descongelar
un frasco de 100 ml de pen/estrep.
Depositar
alícuotas de 4 ml dentro de tubos estériles de
5 ml.
Almacenar a -20°C indefinidamente.
Solución
Madre 16: Penicilina/Estreptomicina (Pen/Estrep 10 ml).
Descongelar
un frasco de 100 ml de pen/estrep.
Depositar alícuotas de 10 ml
dentro de tubos estériles de
13 ml.
Almacenar a
-20°C indefinidamente.
Solución
Madre 17: Cloruro de sodio (NaCl).
Disolver 6.665 g en 50 mL
de agua.
Filtre
estérilmente.
Almacenar a
4°C.
Solución
Madre 18: Cloruro de potasio (KCl).
Disolver
0.588 g en 50 mL de agua.
Filtrar
estérilmente.
Almacenar a
4°C.
Solución
Madre 19: Bicarbonato de sodio (NaHCO3)
Disolver
1.052 g en 50 mL de agua.
Filtrar estérilmente.
Almacenar a 4°C
por una semana solamente.
Solución
Madre 20: Fosfato (PO4).
Disolver
0.235 g de NaH2PO4+H2O en 50 mL de agua.
Filtrar estérilmente.
Almacenar a
4°C.
Solución
Madre 21: 1 M HEPES.
Adicionar
119 g de HEPES a 400 mL de agua.
Ajustar el
pH a 7.0 .
Llevar el volumen hasta 500 mL.
Filtrar
estérilmente.
Cubrir el
recipiente con papel aluminio.
Almacenar a
4°C indefinidamente.
Solución
Madre 22: Cloruro de calcio (CaCl2) para TL.
Disolver
1.470 g de CaCl2+2H2O en 50 mL de agua.
Filtrar
estérilmente.
Almacenar a 4°C.
Solución Madre
23: Cloruro de magnesio (MgCl2) para TL.
Disolver 1.017 g de MgCl2+ 6H2O
en 50 mL de agua.
Filtrar
estérilmente.
Almacenar a 4°C.
Solución
Madre 24: Suero Fetal de bovino (FBS, por sus siglas en inglés).
Preparar
alícuotas de 100 μl de suero fetal de bovino
inactivado con
calor en tubos estériles de
microcentrífuga.
Almacenar a
-20°C. 52
PREPARACIÓN DE MEDIOS
Solución salina de
transporte (0.9%).
Preparar solución salina al 0.9% (9 g de
cloruro de sodio (NaCl) por litro) en
agua bidestilada y esterilizada en autoclave
Etiquetar como "Solución salina estéril
0.9% con fecha de elaboración".
Almacenar
indefinidamente a 4°C.
MEDIO PARA RECOLECCIÓN DE
OVOCITOS (MCO).
1.-
Disolver el polvo de TCM-199 sin rojo fenol y sin glutamina con 3.50 g de
bicarbonato de sodio (NaHCO3) para 10 litros (L) en 9 L
de agua bidestilada.
Ajustar el pH a 7.2-7.4 y llevar el volumen a 10 L.
Filtrar estérilmente 400 ml de medio dentro de un frasco de 500 ml.
Almacenar a 4°C indefinidamente.
En las etiquetas deberá decir "Medio
para Colección de Ovocitos –
Suplementos, y fecha de elaboración".
2.
La noche anterior a su utilización, adicionar 1 alícuota de solución Madre
de
BSS+Hep, 1 alícuota de solución madre
de glutamina (4 ml), y 1 alícuota de
solución Madre de Pen/estrep (4 ml).
Cambiar la etiqueta a "+
suplementos".
Cambiar
la fecha y utilízar dentro de una semana.
MEDIO PARA MADURACIÓN DE
OVOCITOS (MMO)
1.-
Preparar alícuotas de 87 ml de TCM-199 y almacénelos a 4°C hasta que los utilice.
2.
La noche anterior a utilizarse, adicionar lo siguiente a una alícuota de
TCM- 199:
1
alícuota de solución Madre de BSS
1
alícuota de solución Madre de
Gentamicina
125
μl de solución Madre de FSH
200
μl de solución Madre de Estradiol
1 ml
de solución Madre de Piruvato de Sodio.
1 ml
de solución Madre de Glutamina.
Cambiar
la etiqueta para que diga " Medio para Maduración de
Ovocitos".
Utilícese
dentro de una semana.
Soluciones
TL – para preparar medios TALPs.
Todos
estos medios pueden ser fabricados o comprados ya preparados de proveedores
como Cell and Molecular Technologies, y Biowhittaker. Cell and Molecular
Technologies tiene sitios de Internet para ordenar información de soluciones TL
http://www.specialtymedia.com/bovineivf.htm e instrucciones para la preparación de
medios.
1.
Para preparar el medio. Mezclar los ingredientes como se describe en la Tabla 7.
Todos los ingredientes son en mililitros.
Ajustar el pH.
Revisar la osmolaridad.
Filtrar estérilmente la solución.
Utilizar
dentro de la
semana siguiente a su preparación.
Anote la fecha de caducidad en la etiqueta
Almacene a 4°C.
Almacene a 4°C.
Medio TALP (Tyrode's
Albúmina-Lactato-Piruvato)
Este
medio se usa para la preparación de los espermatozoides (SpTALP), fertilización
in vitro (IVF-TALP) y lavado de ovocitos y embriones (HEPES-TALP).
1.
Para preparar el medio. Mezclar los ingredientes como se describe en la Tabla 8
El
medio TALP debe filtrarse estéril e inmediatamente y puede ser almacenado
por una semana a 4 ˚C. 54 2.
Si
es para preparar IVF-TALP el medio debe
ser precalentado a 38.5 ˚C en 5% CO2 antes de usarse
Si
es para preparar Sp-TALP y HEPES-TALP
debe precalentarse a 38.5 ˚C en
medio ambiente.
El
Sp-TALP se utiliza durante la purificación de los espermatozoides por “swim-up”
(Parrish et al.,1986) o centrifugación con gradiente por Percol
(Hernández-Ledzema et al.,1993).
El
HEPES-TALP se utiliza para lavar ovocitos después de la maduración y embriones
después de la fertilización.
El
IVFTALP es el medio utilizado para la fertilización:
Tanto
los ovocitos maduros como el semen purificado se colocan en este medio. S
Solución Madre SP-TL (10X)
Disolver
en 100 ml de agua:
NaCl - 4.675 g
KCl - 0.23 g
NaH2PO4 + H2O - 0.40 g
HEPES 2.38 g
Ajuste el pH a 7.
Filtrar estérilmente y almacene
indefinidamente a 4°C.
PERCOLL® SIGMA-ALDRICH
Número
de catálogo P4937- PP 1644 – P7828
Es
el medio clásico para la centrifugación en
gradientes de densidad celular durante el proceso de FIV.
Está
compuesto por partículas de silice coloidales de 15-30 nm de diámetro, revestidas
con polivinilirrolidona (PVP), lo cual hace que no sea toxico y si ideal para el uso con material biológico.
Debido a la heterogenicidad en el tamaño de las partículas, la
sedimentación se presenta en diferentes
porcentajes, creando espontáneamente gradientes isométricos muy uniformes en un
rango de 1.0 a 1.3 g/ml. La mayoría de las partículas biológicas que tienen un
coeficiente de sedimentación mayor de 60S pueden aislarse con éxito en gradientes
de Percoll®.
Tiene
baja osmolaridad lo que permite un
ajuste preciso a las condiciones fisiológicas de las células sin que
haya interferencia alguna por parte del medio.
Es
compatible con las células vivas lo que permite su separación y recuperación
intacta, con todas sus actividades
sistémicas.
Es
impermeable a las membranas biológicas,
por lo que no hay intercambio debido a la diferencia de concentración.
La
formación espontánea del gradiente durante la centrifugación, permite la mezcla
de muestras de gran volumen en el tubo de centrífuga.
Su
baja viscosidad facilita la formación rápida de gradientes y separación de
partículas.
El Percoll®
se puede mezclar con soluciones salinas balanceadas, solución salina
fisiológica o sucrosa 0.25 M. www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e0414
Percol al 90 %.
Colocar 2 ml de SP-TL (10X) en un vaso de
precipitado pequeño.
Adicionar 0.042 g de bicarbonato de sodio.
Adicionar 45 μl de lactato de Na Solución
Madre.
Revuelva hasta que el bicarbonato se
disuelva.
Adicionar 18 ml de Percol.
Adicionar 79 μl de MgCl2 Solución Stock Madre
Adicionar39 μl de CaCl2 Solución Madre.
Mientras se mezcla, ajuste el pH de 7.3 a
7.45 y
Filtre
con un filtro de 0.45 μm (filtro de tubo de 50 ml o uno similar como el filtro
de cuello de botella.
Algunos
utilizan cantidades dobles para la preparación de la solución de “PERCOLL”
Si
se forma un precipitado en la solución
Percol, continué revolviendo.
Si
los compuestos ya no se disuelven, comience de nuevo.
Nota:
Es muy fácil que se formen precipitados durante el ajuste de pH, si se adicionan
rápidamente el ácido o la base, Por lo tanto es recomendable que este
paso se realice lentamente.
Percoll al 45%
·
Colocar en un tubo de 15
ml 1.5 ml de
Percoll al 90%
·
Adicionar 1.5
ml de Sperm-TALP.
·
Mezclar en
el vortex una
sola vez
PREPARACION LIQUIDO FOLICULAR
- Puncionar folículos preovulatorios de más de 8 mm de diámetro y se transfieren a tubos de centrífuga.
- Centrifugar 2 veces a 500 G (2.500 rpm) durante 30 minutos.
- El líquido sobrenadante se inactiva en baño María a 58°C durante 20 minutos.
- Fraccionar en tubos pequeños o crioviales y almacenar congelado.
MEDIOS PARA EL CULTIVO DE EMBRIONES.
En
esta sección se describen algunos medios definidos (KSOM, CR1aa, CR2) para el
cultivo de embriones. La utilización de co-cultivos con células de la granulosa
se explica en el Apéndice A.
KSOM
Es
un medio utilizado para el cultivo in vitro de los embriones.
Compre KSOM de un proveedor (disponible en
Cell and Molecular
Technologies)
Almacenar congelado.
Utilicese
con cautela después de la fecha de vencimiento suministrada por
el fabricante.
Una vez descongelado, mantenga a 4°C por 2
semanas.
Para
preparar una solución Madre de KSOM de 5 ml, adicione: -
Seroalbumina
bovina (SAB), AGELF- 15 mg (3.00 mg/ml).
Gentamicina
(Solución Madre A) 2.5 μl (0.5 μl/ml)
Aminoácidos
No esenciales (100X) - 50 μl
Aminoácidos
esenciales (50X) - 100 μl
Filtre
estérilmente el medio a través de una jeringa con filtro de 0.22 μm dentro de
un vaso de precipitado estéril de 10 ml. Utilice inmediatamente.
CR1aa
Este
es un medio de cultivo alternativo para
embriones bovinos. La patente de
este medio de cultivo pertenece al laboratorio Infigen de los Estados Unidos de
América (http://www.infingen.com).
Solución Madre CR1:
NaCl 0.670 g
KCl 0.023 g
NaHCO3 0.220 g
Piruvato de Na 0.004 g
Glutamina 0.015 g
Lactato Hemi-Ca 0.055 g
Adicionar los primeros 5 ingredientes a un
matráz volumétrico.
Añada agua (solo 90 ml).
Disuelva totalmente los constituyentes y
agregue el Lactato Hemi-Calcio.
Luego adicione el agua restante.
Almacenar hasta por 2 días a 4°C.
Nota: Los constituyentes de este medio se
pueden precipitar en la solución.
Para minimizar las posibilidades de que esto
ocurra, hay que cerciorarse
que todos los constituyentes estén disueltos
antes de añadir el Lactato
Hemi-Calcio
Utilizar inmediatamente después de elaborado.
Si un medio tiene una apariencia blanca o
nublosa, hay que descartarlo y
comensar de nuevo.
Para
preparar el CR1aa, hay que adicionar los siguientes ingredientes a los 5 ml de
la Solución Madre CR1: -
Seroalbumina
bovina (SAB), AGELF- 15 mg (3.00 mg/ml)
Gentamicina
(Solución Madre 8A) - 2.5 μl (0.5 μl/ml)
Aminoácidos
No esenciales, 100X - 50 μl
Aminoácidos
esenciales 50X - 100 μl
Filtrar
estérilmente el medio a través de un filtro de jeringa de 0.22 μm dentro de un
vaso de precipitado estéril de 10 ml.
Utilicese
inmediatamente en fresco o refrigérese.
El
CR1aa debe ser elaborarse nuevo de una
Solución Madre CR1 sacada del refrigerador.
No
refrigere la porción desrefrigerada sin utilizar.
En
general los embriones son cultivados en microgotas de 5 ml de CR1aa cubiertas
con aceite mineral (hay que utilizar aceite de Sigma probado con embriones o
aceite preequilibrado con agua para permitir que los compuestos embriotóxicos
salgan del aceite).
Para
hacer las microgotas, pipetear 5 ml del medio CR1aa dentro del fondo de una
caja Petri (se pueden preparar más de 9 gotas en una caja de petri de 150
mm).
Adicionar
lentamente una capa del aceite mineral
sobre las gotas y luego adicionar 45 ml de medio CR1aa a cada gota después de
adicionar el aceite.
Preequilibrar
las gotas por 2 h a 38.5 °C y 5% CO2 antes de adicionar los embriones.
Adicionar
cerca de 30 embriones a cada gota, comenzando de 8 a10 h después de la
fertilización.
Los
embriones deben ser lavados exhaustivamente en la solución HEPES-TALP antes de
colocarlos en las gotas.
En
el día 5 después de la fertilización, adicionar 5 ml de suero fetal inactivado
con calor a cada gota.
Los
blastocistos se pueden encontrar después del día 7 de fertilización.
CR2
Es
un medio más sencillo para cultivo de embriones, en la Tabla 9 se muestran sus
componentes.
SOLUCIONES BASICAS
COMERCIALES
Dentro
de las soluciones básicas comerciales se dispone de productos
tales como:
Medio Buffer Fosfato
Salino PBS
Se
emplea para suministrar un Sistema buffer de cultivo de células en un rango de
pH fisiológico o para irrigar, transportar o diluir líquidos mientras se mantiene
la tonicidad y viabilidad celular
PBS
Dulbecco GIBCO ®. Producto
comercial disponible en varias formulaciones y formatos según las
necesidades específicas de investigación
PBS
en base a Sobres Nissui Co Ltd listos para restituir.
Sobre A: PBS (-), piruvato de sodio y glucosa
Sobre B: Sales metálicas Ca Cl2
MEDIO TCM 199
Es
una mezcla de sales de Earle y 0.25 Mn Heps enriquecidas con aminoácidos,
vitaminas y componentes esenciales para el crecimiento y desarrollo celular, actuando como solución nutritiva.
En
general la formula no tiene variaciones marcadas en referencia a las casas
comerciales que los producen.
TCM
199 VITROCELL – EMBRIOLIFE
Presentación:
Frasco con polvo para preparar 1 – 10 –
50 Lts
Estable
por 24 meses
Frasco con 100 o 500 ml
TM 199 MINITUB IVP medios
Presentación:
Solución madre x 50 ml
Conservar entre 4 °C+ y – 8°C hasta por 6 meses.
MEDIOS DE
MADURACION
Compuestos
por la solución madre adicionados de Hormonas (FSH – LH), Suero Fetal
Bovino (SFb), Suero de Vaca en celo (SVC) o Liquido Folicular (LF)
TM
199 Medio de Maduración de Ovocitos Minitub IVP Medios
Frasco x 50 ml Solución madre
Adicionar FSH-LH y 5% de SFb o SVC
Almacenar frasco cerrado por hasta 6
meses a +4 – 8°C
M-TCM-199
Medio de Maduración
Para
preparar 20 ml
TCM-199
17 ml
Penicilina 2.000 UI
Estreptomicina 2 mg
SFb (5%) 1 ml
LFb (10%) 2 ml
1.-
Disolver 17 ml de solución TCM-199 con los antibióticos
2.-
Agregar el SFb y LFb
3.-
Filtrar (0.22µ)
4.-
Colocar en estufa con tapa floja (30°C y 5% de CO2 y 100% de humedad)
(FILIPIAK)
MEDIO HAM F -10 VITROCELL-EMBRIOLIFE
Es
similar al TCM 199, con algunas variaciones como la adición de piruvato de
sodio. Es extremadamente higroscópico por lo que debe protegerse del medio
ambiente. No se recomienda la preparación de concentraciones mayores a las
específicadas debido a la gran posibilidad de formar precipitados.
MEDIO TALP
(Tyroid de Albumin Lactate Pyruvate) (www.Caissonlabs.com)
BSA
(Bovine Serum Albumin) (85040C SIGMA)
Piruvato
de Sodio
Gentamicina
Heparina
Almacenar entre 2° y 8°C
Presentación:
Caja de 6 X 100 ml
MEDIO
BO (BRACKET & OLIPHANT)
De esta solución se preparan los medios de lavado de ovocitos, lavado y dilución de semen. (FILIPIAK)
FERTILIZACION IN VITRO FIV
Durante este proceso los ovocitos maduros colocados previamente en cajas con 4 depósitos en medio de cultivo, reciben una concentración adecuada de espermatozoides con motilidad progresiva previamente seleccionados para que se produzca la fecundación.
Este proceso requiere de los siguientes pasos:
1.- Separación de los espermatozoides móviles de la muestra a tratar.
2.- Capacitación espermática
3.- Fecundación propiamente dicha.
Durante este proceso los ovocitos maduros colocados previamente en cajas con 4 depósitos en medio de cultivo, reciben una concentración adecuada de espermatozoides con motilidad progresiva previamente seleccionados para que se produzca la fecundación.
Este proceso requiere de los siguientes pasos:
1.- Separación de los espermatozoides móviles de la muestra a tratar.
2.- Capacitación espermática
3.- Fecundación propiamente dicha.
SEPARACION DE LOS ESPERMATOZOIDES
Un
primer requisito en el proceso de preparación de los espermatozoides para la
FIV bovina incluye su separación del plasma seminal, del diluyente y/o del
crioprotector. Este proceso permite la selección de una subpoblación
espermática que presente una buena motilidad. Entre los métodos de selección de
espermatozoides bovinos destacan la técnica de Swim-up (PARRISH y FOOTE, 1987),
la Centrifugación en Gradientes de Densidad (SAEKI et al., 1990), la migración a través
de una columna de ácido hialurónico (SHAMSUDDIN y RODRIGUEZ MARTINEZ,
1994) y la filtración a través de lana de vidrio (PEREIRA et al., 1999).
(GARDON)
Igualmente
se ha empleado en bovinos, la técnica de
Migración Sedimentación utilizada en humanos, la cual ha sido adaptada para
simplificar el proceso de fertilización in vitro.
La técnica de separación espermática ideal, debe ser
rápida, fácil de efectuar y separar el
máximo de células espermáticas móviles, sin que ocasione ningún daño a las
células aisladas.
Dado que ninguna técnica de separación de
espermatozoides se comporta como método ideal, es necesario utilizar la técnica
más adecuada en cada caso en particular, con el fin de obtener un número óptimo
de espermatozoides competentes. Por lo tanto dependiendo de la calidad de la
muestra espermática, cada método tiene una eficacia diferente. (SEFERTILIDAD)
Es esencial por lo
tanto seleccionar de la muestra
del eyaculado, la mayor cantidad de espermatozoides móviles y
anatómicamente funcionales, lo
más pronto posible, puesto que algunos
componentes del mismo alteran la capacidad de fertilización del espermatozoide. Así, los espermatozoides y leucocitos producen
muchos radicales de oxígeno (ROS) (Bjorndahl et al., 2005; Mortimer et al.,
1998), que influyen negativamente la fertilidad del espermatozoide.
La elección del método
de separación de espermatozoides
funcionales depende de la calidad de la
muestra.
La preparación de los espermatozoides para la fecundación in vitro
afecta el patrón de capacitación y reacción acrosómica, de manera que pueden
ser determinantes para el proceso de fecundación. (GARDON)
Los métodos de selección de los espermatozoides
utilizados en FIV pueden afectar la proporción macho hembra de los embriones,
separando los espermatozoides de acuerdo con su cromosoma X o Y, debido a
ciertas características, como diferencias de masa, motilidad o contenido de ADN
Dentro de los factores que pueden influir el desvío
en la proporción Macho-
Hembra el método de preparación de los espermatozoides para FIV es el más fácil
de manipular, por lo que puede utilizarse para reducir la proporción de machos,
determinada por otros factores que no pueden manipularse con facilidad, como la
velocidad de desarrollo de acuerdo al sexo y la mayor sensibilidad de los
embriones del sexo femenino a la manipulación, lo que produce un desvío menor,
más próximo de lo esperado. (RHEINGANTZ
TECNICA DE
SWIM UP
Mediante esta técnica se seleccionan los espermatozoides en base a
su motilidad y capacidad de separación del plasma seminal. Es la técnica preferida si la muestra de
semen tiene un número normal de espermatozoides (normospermia).
Si se efectúa la técnica de “Swim up directa”, luego de la
fluidificación de la muestra, el volumen total (bien mezclado) se divide en
fracciones de 1 ml en los tubos de centrífuga, preferiblemente de punta cónica.
Se deposita con mucho cuidado 1.3 ml de medio de cultivo sobre el
semen en cada tubo. Los tubos se colocan inclinados dentro de la incubadora, en un ángulo de 45°,
incubándolos a 37°C durante 30 a 60 minutos. Al inclinar el tubo a 45° se aumenta la superficie entre el
medio y el semen, mejorando la capacidad de los espematozoides para separarse
del semen y alcanzar el medio. Después de esto los tubos vuelven a la posición
vertical. Se retira 1 ml de la porción sobrenadante de cada tubo, aspirando los
espermatozoides del menisco superior, con una pipeta esteril.
Una alternativa es la de colocar el
medio de cultivo en cada tubo y depositar luego bajo el medio el semen, con
el fin de obtener una superficie más
clara entre el semen y el medio.
Adicionalmente, se puede optimizar la
recuperación del semen aumentando el número de tubos y disminuyendo el volumen de semen en cada
tubo.
Una vez separado el sobrenadante se adicionan
2 ml de medio a cada tubo y se centrifuga a 300 g por 10 minutos.
El “swim up indirecto”, se realiza con
el pellet de semen formado por la centrifugación, seguido de la estratificación
del medio sobre el pellet resuspendido.
El semen fluidificado se divide en
fracciones de 1 ml en cada tubo, adicionándose medio en proporción 1:1 y luego
de centrifugar se retira suavemente el sobrenadante.
Sobre el pellet resuspendido se adiciona
cuidadosamente 1.3 ml de medio y se colocan los tubos inclinados 45° dentro de
la incubadora, por 30 a 60 minutos a 37°C. Después de la migración de los
espermatozoides, se hace recuento y evaluación de motilidad y se remueve el
volumen de semen para IA.
En el “swim up directo” se efectúa la
centrifugación luego de la migración de los espermatozoides, o sea, después de
la separación de los espermatozoides buenos de los leucocitos y espermatozoides
muertos. Estas muestras producen generalmente Especies Reactivas de Oxígeno (ROS), de tal manera que
el “swim up directo” es el método preferido con respecto al “indirecto” para
seleccionar espermatozoides para IA. (NATALI)
PROCEDIMIENTO
Se puede utilizar como medio DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium) Sigma-Aldrich®. (LUCIO)
Se ha determinado que el método de Swim Up produce un mayor porcentaje de
embriones machos producidos in vitro, en comparación con el método de
centrifugación de gradientes de densidad ("Percoll"), incubados en un período de
45 minutos. (RHEINGANTZ)
En otro trabajo se observó que a medida que aumenta el tiempo de incubación durante el Swim up, se presentó una disminución gradual en la proporción de hembras, entre los embriones producidos. En el período más largo (90 minutos) se observó una proporción sexual de 60% de machos, aunque sin ser estadísticamente representativo (Grafico 4)
Una
explicación para esto sería la posibilidad de que los espermatozoides
portadores del cromosoma X sean menos
resistentes al cultivo in vitro, lo que explicaría su disminución a medida que aumenta el tiempo de incubación.
(RHEINGANTZ 2006)
MIGRACION
SEDIMENTACION
Esta
técnica consiste en un proceso similar
al de swim up combinado con un paso de sedimentación, y aprovecha la capacidad
de los espermatozoides para desplazarse.
Se
utilizan unos tubos especiales con dos cámaras concéntricas, una central cónica
de mayor profundidad, y una externa, concéntrica a la anterior,
a modo de galería
El
tubo cónico interior de la cámara de migración y la cámara que lo rodea se
llena con medio de cultivo.
Se
añade con cuidado el semen al fondo del tubo exterior, y se deja incubar el
conjunto a 37ºC / 5% CO2.
Los
espermatozoides nadan desde el tubo exterior al medio de cultivo contenido en
el tubo interior y sedimentan en la
parte cónica inferior tras un tiempo de incubación de aproximadamente 1 hora.
A
continuación se recoge el esperma del fondo del tubo cónico interior que es el
que se utilizará para las técnicas de reproducción asistida. (CULTEK)
Esta técnica se implementó en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad del Tolima, con asesoria de CECOLFES, Dr Elkin Lucena y Jorge Ramirez, Trabajo de grado de la Dra
Luz Stella Tobar 1984. Capacitación Espermática Mediante Técnica de Migración
Sedimentación.
Una
variante de la técnica de migración sedimentación fue elaborada por URREGO et
al, en la cual se
omitió la centrifugación de los espermatozoides para los procesos de lavado y
selección espermática.
Dentro de
cada uno de los depósitos de los platos convencionales 4X depósitos externos)
se introdujo un nuevo depósito más pequeño (depósitos internos) de
aproximadamente 50 μl hecho en material de vidrio (0.3 mm de alto por 0.8 mm de
diámetro).
El
procedimiento consiste en llenar los depósitos interno y externo con 700 μl de medio de fertilización,
hasta que el depósito interno quede cubierto de medio, enseguida se depositaron
10 CCOs por cada depósito interno; luego se depositaron en el fondo del
depósito externo. 30 μl de semen previamente descongelado.
Después de
una hora se removió todo el contenido del depósito externo y se dejó el contenido
del depósito interno con el medio y las células germinales, por un periodo de
incubación de 16 h.
Los presuntos
cigotos fueron cultivados en medio CR1aa por un periodo de siete días con un
cambio de medio a las 72h. Como control, se utilizó un gradiente de Percoll
45-90% para la selección espermática.
La tasa de de
ovocitos divididos fue de (70.8 vs. 73.1) y la proporción de ovocitos que
llegaron al estadio de morúla y blastocisto fue de (18.8 vs. 20.3),
respectivamente.
Los
resultados obtenidos con la nueva propuesta metodológica son similares a los
obtenidos con la metodología convencional (p<0.05). Estos resultados indican
que ambos métodos producen resultados similares pero la nueva propuesta
metodológica permite ahorrar tiempo, es menos laboriosa, consume menos
reactivos y permite reducir la manipulación de las células espermáticas con
buenos efectos eventuales en el mejoramiento de los procedimientos de
reproducción in vitro. (URREGO)
CENTRIFUGACION GRADIENTES DE DENSIDAD
PERCOLL®
La separación de gradientes de Percoll®
permite obtener un alto número de
espermatozoides móviles, siendo un método de alta repetibilidad. Con esta
técnica se obtiene una tasa menor de fecundación in vitro que cuando se utiliza
el sistema de Swim-up. Sin embargo, el porcentaje de blastocistos logrado en ambas técnicas es similar. (PARRISH).
Estas diferencias en las tasas de penetración
podrían ser debidas al diferente patrón de capacitación y reacción acrosómica
que presentan los espermatozoides sometidos a la columna de Percoll. De este modo,
la aceleración del proceso daría lugar a que un gran número de espermatozoides
estuvieran capacitados más rápidamente tras la preparación pero su vida media
acortada, de modo que las tasas de penetración estarían reducidas.
Estos
datos confirman que la preparación de los espermatozoides para la fecundación
in vitro afecta al patrón de capacitación y reacción acrosómica, ya que la adición
de heparina y cafeína produce un incremento significativo de espermatozoides con
acrosomas reaccionados y el empleo de columnas de Percoll acelera el proceso de
reacción acrosómica.
La
técnica preferida es la centrifugación de gradiantes discontinuos de Percoll
(45-90%) para asegurar la mayor recuperación de espermatozoides móviles. La
concentración determinada de espermatozoides se diluye en bicarbonato buferado
TAPL IVF con 10 mcg/ml de heparina. (GALLI)
Esta técnica permite
mediante gradientes de densidad discontinua,
la separación de los espermatozoides buenos de los espermatozoides muertos, leucocitos y otros
componentes del plasma seminal. Durante la centrifugación de la muestra
a través del gradiente del silicato
coloidal cubierto con sílice pueden seleccionarse las células con diferente
motilidad y densidad. Los espermatozoides con alta motilidad y buena morfología
están en el pellet depositado en la punta del tubo cónico, libres de
espermatozoides muertos, leucocitos, bacterias y epitelio de descamación. La mayoría de los métodos utilizan dos tipos de gradientes discontinuos, formados por una capa superior de 40% (v/v) y una capa inferior del 80% (v/v). Igualmente se emplean capas de 45% - 90%, o tres capas de 30% - 60% - 90%. Entre más capas mejor será la selección de los espermatozoides.
El medio de gradiente de densidad está disponible en productos
comerciales listos para utilizar o para
preparar las diferentes capas de densidad. Los gradientes se preparan adicionando al
Percoll ® soluciones isotónicas
estéril como BWW, HAM F-10, HTF, TALP.
Una vez preparado el gradiente de densidad se procede a la
colocación de la muestra de semen, en la parte superior del gradiente.
Seguidamente se centrifuga la preparación
obtenida, por el tiempo estipulado en cada protocolo establecido por el
laboratorio.
El tiempo y la fuerza de
centrifugación pueden variar
dependiendo de la calidad de la muestra:
por ejemplo, el tiempo de centrifugación puede incrementarse en muestras con
alta viscosidad.
Luego de la centrifugación debe retirarse suavemente la mayor
cantidad de sobrenadante.
El pellet de semen en
la punta del
tubo cónico se diluye nuevamente
en 5 ml
de medio y se centrifuga a 200
g por 10 minutos. Finalizada la
centrifugación se remueve el sobrenadante y la
muestra está lista para
utilizar en cualquier técnica de reproducción asistida
(IA o FIV). (NATALI)
El procedimiento se describe con mayor detalle al hablar más adelante de la Fertilización In Vitro propiamente dicha.
El procedimiento se describe con mayor detalle al hablar más adelante de la Fertilización In Vitro propiamente dicha.
La técnica de
Swim up y de centrifugación de Gradientes de Densidad tienen eficiencias
diferentes en la separación de los
espermatozoides. Los espermatozoides aislado mediante Swim up son limpios y
móviles, con una alta integridad del ADN, pero son lesionados por las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS). Los espermatozoides aislados por Centrifugación de Gradientes de
Densidad, no son lesionados por los ROS, pero tienen una baja integridad del
ADN.
CAPACITACION ESPERMATICA
Se ha definido a la capacitación como los cambios que preparan al espermatozoide para la hiperactivación y reacción del acrosoma. Esta última es un prerrequisito para la penetración de la zona pelúcida y la fusión del espermtozoide con la membrana plasmática del ovocito, constituyendo un mecanismo de control par a la fecundación. (De los Reyes)
Entre los cambios que ocurren durante la capacitación, previo a la hiperactivación y reacción acrosómica, se encuentran los siguientes: Alteración de las glicoproteínas de la superficie del espermatozoide. Modificaciones de la sproteínas y lípidos de la membrana plasmática al calcio. Activación del sistema adenil ciclasa (Yanagimachi 1989; Fraser 1990)
Las evidencias indican que para que estos cambios ocurran es necesario el calcio extracelular, al menos parte del que es interiorizado. Se sabe que el aumento intracelular del Ca++, provoca variadas respuestas, entre ellas la estimulación de la adenil ciclasa, lo que a su vez induce un aumento en el AMPc y la activación de fosfolipasas asociadas a la membrana, con la consiguiente alteración de la membrana plasmática.
La capacitación de los espermatozoides puede realizarse mediante el uso de sustancias fisiológicas como las células del cúmulo ooforo. (MATTIOLI et al., 1998), el fluido folicular (SUAREZ et al., 1986), el fluido oviductal (GRIPPO ET AL., 1995), la progesterona (CHENG et al., 1998), las proteínas de la zona pelúcida (WASSARMAN, 1990) y los glicosaminoglicanos como la heparina (PARRISH et al., 1988). También se han usado con éxito sustancias no fisiológicas como el ionóforo de calcio A23187 (JANUSKAUSKAS et al., 2000). (GARDON)
La reacción acrosómica se puede considerar como una exocitosis en que las membranas plasmáticas y acrosómica externa se fenestran y fusionan progresivamente entre si, permitiendo que el espermatozoide establezca una unión secundaria con la zona pelúcida, iniciando así su paso a través de ella para más tarde fusionarse con la membrana plasmática del ovocito.
Para estudiar la reacción acrosómica se ha utilizado con éxito diversas técnicas como la clásica microscopía de contraste interdiferencial (SAAKE y MARSHALL,1968), diversas tinciones y microscopía de campo claro (WAY et al., 1995), lectinas unidas a fluoresceína y anticuerpos monoclonales (PARINAUD et AL., 1993). (GARDON)
Tradicionalmente se
ha empleado un medio de cultivo específico para cada una de las fases del sistema de producción in vitro de embriones,
por lo que se busca la posibilidad de utilizar un medio único que cumpla los requisitos de cada
una de las fases. Esta posibilidad facilitaría las labores y tareas en el laboratorio y el trabajo
experimental. Por otra parte, sabemos que el medio utilizado
en la FIV podría tener una importancia fundamental al ejercer efectos tanto en
la reacción acrosómica del espermatozoide como en la penetrabilidad de los
ovocitos y en el desarrollo embrionario posterior.
La
composición del medio de FIV va a condicionar la posibilidad de desarrollo de
la reacción acrosómica, fase fundamental para el proceso de fecundación en la
que se produce la fusión de la membrana acrosomal externa con la membrana
plasmática del espermatozoide.
En
un trabajo realizado por GARDON et al., se concluyó que el porcentaje de
espermatozoides intactos es superior en el medio TCM-199 (valor medio 30.93±1.18) que
en TALP (28.79±1.40) o BO (26.53±1.31). La reacción acrosómica está acelerada
en los medios TALP y BO en relación con el medio TCM-199, siendo el medio TALP el que induce un mayor porcentaje de espermatozoides
con reacción acrosómica (valor medio TALP 9.33±0.81, TCM-199 6.76±0.64 BO
7.33±0.54), mientras que los espermatozoides cultivados en el medio TCM-199
presentan un retraso en el patrón de reacción acrosómica.
Para utilizar con más
éxito el medio TCM-199 en el proceso de
FIV es necesario ajustar
variables como la concentración de Ca++ y de los inductores de la capacitación
(heparina y cafeína) que permitan acelerar los procesos de capacitación y
reacción acrosómica. (GARDON)
Lo anterior refleja la importancia de los medios en la FIV, por lo que la tendencia de los profesionales de los diferentes laboratorios en los Centros de Reproducción Asistida, es la de preparar sus propios medios, ajustando las cantidades y componentes, al protocolo que mejores resultados, en cuanto a índices de preñez, han obtenido.
Para utilizar con más
éxito el medio TCM-199 en el proceso de
FIV es necesario ajustar
variables como la concentración de Ca++ y de los inductores de la capacitación
(heparina y cafeína) que permitan acelerar los procesos de capacitación y
reacción acrosómica. (GARDON)
Tanto la heparina como el condroitin sulfato A,B, o C y el ácido hialurónico promueven la reacción acrosómica en espermatozoides bovinos, su acción inductora estaría a el relacionada al grado de sulfatación de los compuestos, siendo la heparina el GAG con mayor efecto inductor. Esta propiedad sería una acción indirecta que dispondría a los espermatozoides para responder al calcio, requisito obligatorio para que ocurra la reacción acrosómica y para activar los cambios de membrana típicos de este fenómeno.
La heparina se uniría específicamente a los espermatozoides en forma saturable, reversible, dependiente del pH, la temperatura y la concentración de calcio en el medio, promoviendo la captación de este ión por parte de las células a través de los canales iónicos provocando el incremento de los niveles de AMPc. Sin embargo, la localización del receptor de la heparina en el espermatozoide bovino, aún no ha sido bien determinada y es posible que estos eventos estén confinados a la región anterior de la cabeza del espermatozoide.
La capacitación espermática en bovinos, dada por la heparina, depende de su concentración en el medio de incubación, así, se describen tasas de fecundación in vitro sobre 70%, utilizando dosis entre 10 µg/ml a 20 µg/ml de heparina. También el tiempo de incubación afectaría la respuesta de los espermatozoides bovinos alcanzando la saturación a las 2 horas; sin embargo, la capacidad fecundante de estos se empieza a expresar después de las 2.5 horas, manifestándose plenamente cuando los espermatozoides son incubados por 4 horas.
Tanto la heparina como el condroitin sulfato A,B, o C y el ácido hialurónico promueven la reacción acrosómica en espermatozoides bovinos, su acción inductora estaría a el relacionada al grado de sulfatación de los compuestos, siendo la heparina el GAG con mayor efecto inductor. Esta propiedad sería una acción indirecta que dispondría a los espermatozoides para responder al calcio, requisito obligatorio para que ocurra la reacción acrosómica y para activar los cambios de membrana típicos de este fenómeno.
La heparina se uniría específicamente a los espermatozoides en forma saturable, reversible, dependiente del pH, la temperatura y la concentración de calcio en el medio, promoviendo la captación de este ión por parte de las células a través de los canales iónicos provocando el incremento de los niveles de AMPc. Sin embargo, la localización del receptor de la heparina en el espermatozoide bovino, aún no ha sido bien determinada y es posible que estos eventos estén confinados a la región anterior de la cabeza del espermatozoide.
La capacitación espermática en bovinos, dada por la heparina, depende de su concentración en el medio de incubación, así, se describen tasas de fecundación in vitro sobre 70%, utilizando dosis entre 10 µg/ml a 20 µg/ml de heparina. También el tiempo de incubación afectaría la respuesta de los espermatozoides bovinos alcanzando la saturación a las 2 horas; sin embargo, la capacidad fecundante de estos se empieza a expresar después de las 2.5 horas, manifestándose plenamente cuando los espermatozoides son incubados por 4 horas.
Lo anterior refleja la importancia de los medios en la FIV, por lo que la tendencia de los profesionales de los diferentes laboratorios en los Centros de Reproducción Asistida, es la de preparar sus propios medios, ajustando las cantidades y componentes, al protocolo que mejores resultados, en cuanto a índices de preñez, han obtenido.
FERTILIZACION
DE LOS OVOCITOS
La fecundación es la culminación de una serie de eventos previo que como se vio involucran mecanismo complejos de reconocimiento celular e interacción gamética.
De una adecuada maduración nuclear y citoplasmática de los ovocitos y una eficiente capacitación de los espermatozoides, depende en gran medida el éxito de esta interacción in vitro.
Una vez que disponemos de ovocitos maduros, el siguiente objetivo es lograr la fecundación de los mismos, para ello se incuban junto con espermatozoides capacitados en un medio suplementado con fuentes energéticas (piruvato, lactato) y albúmina sérica
Simular en mejor forma las condiciones naturales durante la fecundación in vitro, incluye mantener una atmosfera de CO2 (5%) y otros gases junto con una temperatura adecuada (39°C) durante la coincubación que es aproximadamente de 20 horas. Los espermatozoides criopreservados comienzan a penetrar los ovocitos maduros denudados a las 3 horas de iniciada la coincubación.
En términos generales se prepara una caja de Petri y con el semen ya capacitado y diluido a la concentración deseada, se preparan gotas para la inseminación, cubiertas con aceite mineral. Se retiran los ovocitos del medio de maduración, que estaban en la incubadora y se distribuyen por grupos, en una proporción de 10 a 30 ovocitos en 100 µl aproximadamente. (FILIPIAK)
El semen empleado es generalmente congelado/descongelado de toros de alta calidad genética, aumentándose su potencial cuando se emplea semen sexado para obtener crías en función de los objetivos productivos de la explotación, como por ejemplo generar solo hembras en ganaderías de leche.
Más
del 90% de los reproductores pueden emplearse en la fertilización de los ovocitos
IV, ajustando adecuadamente la concentración espermática para cada toro, ya que
no todos los reproductores producen un buen porcentaje de embriones.
En
la Figura 22 se observa que
en 15 toros
utilizados en FIV
el porcentaje de
preñez tuvo una variación
entre 22.2% y el 80%.
Así mismo al utilizar la
vaca 118/2 cuyo desempeño entre
los años 2008 – 2012 en un programa de FIV, su porcentaje de preñez fue de
49.5%, se aprecia que su comportamiento fue variable al utilizar diferentes
toros. (GOMEZ)
Por
lo anterior se puede esperar que el comportamiento individual de un toro en
particular sea constante.
La
Fertilización In vitro de los ovocitos maduros requiere del empleo y
preparación de medios para su fertilización, incubación y mantenimiento; un equipo adecuado y protocolos específicos para su
realización.
A manera de información relacionamos la adaptación de un Protocolo de Fertilización In Vitro tomado de los utilizados por RIVERA et al, GARCIA et al, FERNANDEZ et al, el cual puede aplicarse, según el criterio del profesional o el Centro de
Reproducción Asistida.
DIA - 1
Los
medios para fertilización deben prepararse al menos un día antes (Dia – 1) para
que estén listos para ser utilizados cuando sea necesario.
HEPES –TL
HEPES-TALP
IVF-TL
IVF-TALP
Sp-TL
Sp-TALP
FERTILIZACION IN
VITRO
MATERIALES
Y EQUIPO
·
Cámara de flujo laminar.
·
Microscopio
·
Termo de congelación con las pajillas de
los toros a
utilizar.
·
Termo de descongelación
·
Centrifuga
con 3 recipientes
·
Tijeras o corta pajillas
·
Embolo para impulsar el semen
·
Cámara de New Bauer
·
Tubos cónicos de centrifugación de 15 ml =
7
·
Cajas X
de 4 recipientes (nunclon) para fertilizar.
·
Pipeteador de 1000 microlitros.
·
Pipeteador
25 microlitro.
·
Puntas
para pipeteador.
·
Pipetas estériles (1 X 5 ml y 1 X 2 ml)
·
Pipetas Pasteur plásticas.
·
Manipulador de embriones o jeringa
·
Placa térmica 38.5°C
·
Cajas de Petri 60 x 15.
·
Toallas de
papel
·
Percoll ® 90%
·
IVF-TALP
·
HEPES-TALP
·
PHE
·
Alcohol
PROCEDIMIENTO
DIA
DE LA FERTILIZACION = DIA 0
1.- Alistar el equipo y medios 2 a 3 horas antes de la fertilización.
2.- Depositar 15 ml de HEPES-TALP en un tubo cónico de 15 ml.
Tapelos y colóquelos en la incubadora a 38.5°C
Marque la fecha y utilícelos el mismo día.
Parece que 4 a 5 tubos es mucho, pero algunos de estos tubos de HEPES-TALP serán utilizados más tarde durante el día.
3.- Deposite 10 ml de Sp-TALP (puede utilizarse HEPES-TALP) en un tubo cónico de 15 ml
4.- Tápelos y colóquelos en incubadora a 38.5°C y 5% de CO2.
5.- Deposite 5 ml de IVF-TALP en un tubo cónico de 15 ml.
6.- Deje la tapa suelta y colóquelo en la incubadora.
7.- Alistar las cajas X por 4 recipientes, que sean necesarias, teniendo en cuenta que se colocarán 30 CCOs maduros por recipiente.
8.- Depositar 600 microlitros de IVF-TALP por recipiente.
9.- Permitir que el medio se equilibre y entibie por 2 horas en incubadora.
10.- Colocar las cajas X en la incubadora a 38.5°C y 5% de CO2, 2 horas nates de realizar la fecundación.
11.- Depositar 3 ml de Percoll ® 90% en un tubo cónico de 15 ml.
12.- Colocar el Percoll ® 90% en incubadora a 38.5°C por lo menos 2 horas antes de
procesar el semen.
13.- Conectar el descongelador para que el agua se entibie a 38°C.
14.- Colocar 1 a 2 alícuotas de PHE en la incubadora ( 25 µl por recipiente).
Recuerde cubrir el tubo con papel de aluminio.
15.- Colocar 2 a 3 canastillas de centrífuga en la incubadora para temperarlas.
Preparacion Ovocitos Para fertilización
16.- Colocar una caja X sobre la placa calentadora de láminas.
17.- Colocar 5 ml de HEPES-TALP a cada depósito.
19.- Transferir los CCOs de cada microgota de MMO + suplemento a la caja X que contiene HEPES-TALP.
Para comodidad de manejo de los ovocitos maduros y aumentar la velocidad de este paso, se recomienda transferir el cotenido de 3 microgotas (30 ovocitos maduros) dentro de cada esquina de la caja X. Repetir cuanto sea necesario hasta que todos los ovocitos hayan sido colocados en las esquinas de la caja X en grupos de 30
20.- Retirar de la incubadora la caja X de 4 recipientes con IVF-TALP pre equilibrado (600µl/depósito)
21.- Lavar los ovocitos una sola vez.
22.- Transferir un grupo de 30 ovocitos de una esquina de la caja X a un depósito de una caja de 4 recipientes.
23.- Regresar la caja X con los ovocitos a la incubadora hasta la fertilización.
Preparación Del Semen Para Fertilización
Es imporante que los espermatozoides no sean expuestos a shock térmico frío, por lo que se necesita un calentador ambiental en frente del área de trabajo, en donde se procesará el semen.
También hay que estar seguros que todos los medios a utilizar con los espermatozoides esten temperados a 38.5°C, antes de su utilización mínimo dos horas antes (HEPES-TALP, Sp-TALP, IVF-TALP, PERCOLL® al 90%)
1.- Depositar 5 ml de Percoll® 90% en un tubo cónico de 15 ml
2.- Depositar en un tubo cónico Eppendorf 1.5 ml de Percoll ® 90%.
3.- Adicionar 1.5 ml de Sp-TALP para elaborar el Percoll ® 45%.
4.- Mezcle en el vortex una sola vez.
5.- Depositar 3.0 ml de Percoll 45% en un tubo Eppendorf.
6.- Con una pipeta Pasteur deposite 3 ml de Percoll® al 90%, en el fondo del tubo con el Percoll al 45%, con mucho cuidado sin mezclar los medios, creando un gradiente entre el Percoll® al 45% y el Percoll® al 90%, quedando el Percoll® 45% en la parte superior.
Igualmente puede depositarse el Percoll® 90% y encima el Percoll ® al 45%
Al crearse el gradiente se forma entre ambos un menisco claro.
Si se prepara el gradiente con anticipación, éste debe utilizarse dentro de las 3 horas siguientes a su elaboración.
7.- Retirar 2 a 3 pajillas de semen del termo de congelación..8.- Descongelar las pajillas de semen en el descongelador a 37°C por 45 a 60 segundos. Puede emplearse un baño María a 37°C. Se recomienda el baño María seco, ya que evita la formación de hongos en el medio húmedo.
9.- Seque la pajilla con una toalla o servilleta de papel absorvente.
10.- Corte la punta de la pajilla, opuesto al tapón de algodón, con las tijeras o corta pajillas.
11.- Deposite el semen sobre la superficie del gradiente de Percoll®
Para facilitar el vaciado de las pajillas, se puede fabricar un embolo que empuje el tapón de algodón y expulse el semen. Tenga la precaución de no enturbiar el gradiente y que el semen no pase la línea del Percoll® de 45%.
Una forma fácil y segura es poner la pajilla dentro del tubo con el gradiente de Percoll® y presionar el tapón de algodón hasta que llegue al borde del gradiente.
12.- Colocar el tubo cónico con el semen y el gradiente de Percoll® dentro de una canastilla de centrifuga temperada.
13.- Centrifugar a 300 Xg por 10 minutos.
14.- Luego de centrifugar retirar el pellet de semen formado en el fondo del tubo cónico.
Puesto que el Percoll® es tóxico para las células espermáticas la muestra de semen debe ser recolectada con un mínimo de Percoll®
15.- Deposite la fracción espermática dentro de un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de Sp-TALP y colóquela en una canastilla de centrífuga temperada.16.- Centrifugar a 200 Xg por 5 minutos.
La velocidad exacta probablemente no sea crítica, sin embargo, hay que hacerlo a baja velocidad de centrifugación.
17.- Remover el sobrenadante con una pipeta Pasteur de plástico, teniendo el cuidado de no alterar la fracción espermática en la punta del tubo.
Este paso debe realizarse rápidamente porque los espermatozoides por su motilidad tienden a salirse de la fracción.
Si la fracción espermática se altera accidentalmente hay que parar el proceso y recentrifugar.
Para realizar este paso se adicionan 10 µl de la suspensión de semen a 90 µl de agua para matar los espermatozoides.
Colocar 10 µl de la muestra en la cámara de Neubauer y contar al microscopio los espermatozoides contenidos en 5 cuadros.
Multiplicar el número de espermatozoides por 500.000 para determinar la concentración por ml.
19.- Diluir el semen adicionando IVF-TALP previamente equilibrado den la incubadora, en cantidad que permita la concentración de 4x un millón/ml.
20.- Retirar de la incubadora la caja X con los ovocitos maduros y colocarla en el calentador de láminas.
Durante el pipeteo de los espermatozoides, se debe tener el cuidado de colocar la pipeta en la mitad de la suspensión del fondo, para evitar tomar desechos que puedan asentarse en el fondo del tubo
22.- Colocar la caja X de 4 recipientes en la incubadora por 8 a 10 horas.
Para determinar la incidencia de partenogenesis o división celular, después de las 8 a 10 horas de cultivo, se colocan los ovocitos en una caja X con PHE y se cultivan por 2 días antes de observar el porcentaje de divisiones celulares.
CULTIVO DE EMBRIONES
PREPARACION DE GOTAS DE CULTIVO DE EMBRIONES
1.- Preparar Medio De Cultivo para Embriones (KSOM modificado) al menos 2 horas antes de remover los embriones/ovocitos de las gotas de fertilización.
2.- Entibiar el área de trabajo y el .equipo necesario de manera suficiente para evitar el shock térmico.
3.- Retirar las cajas X de 4 recipientes para FIV.
4.- Remover los embriones/ovocitos de cada recipiente. Colóquelos en un tubo de centrífuga temperado. Repetir hasta que todos los recipientes hayan sido procesados.
5.- Remover las células de los cúmulos de los embriones/ovocitos por agitación con el "vortex", por 5 minutos.
Si es indispensable la remoción de las células del cúmulo, agitar de nuevo con el "vortex" en presencia de 300 µg/ml de Hialuronidasa.
6.- Hacer suficientes microgotas de 50 µl de medio de cultivo (30 ovocitos/embriones por gota) en cajas de Petri de 60 por 15 mm y cúbralas con aceite mineral.
Esto permitirá que los embriones no estén fuera de la incubadora por períodos prolongados. Esto es principalmente importante cuando se está aprendiendo la técnica y no
se tiene suficiente practica en la clasificación de embriones.
7.- Colocar la caja X sobre el entibiador de láminas y adicionar 5 ml de HEPS-TALP en cada uno de los recipientes.
8.- Transferir los embriones/ovocitos del tubo de centrífuga a la caja X y enjuagar el tubo 3 a 4 veces con HEPES-TALP para retirar todos los embriones/ovocitos.
Para evitar derramamiento, dejar el recipiente 1 vacío y colocar HEPES-TALP extra en el recipiente N° 4.
Adicionar embriones/ovocitos al recipiente N°1.
Enjuagar el tubo de centrífuga de 2 a 3 veces con HEPES-TALP del recipiente N°4
Remover las burbujas con la pipeta, para visulizar los embriones y depositar las burbujas en el recipiente N°4, debido a que los embriones algunas veces se sitúan debajo de las burbujas.
Lavar los embriones/ovocitos de 2 a 3 veces transfiriéndolos de un recipiente al siguiente con el propósito de limpiarlos de células y desechos.
9.- Finalmente, transferir los embriones/ovocitos a microgotas de Medio de cultivo pre-equilibrado (CR1aa, KSOM modificado o el medio de elección). Normalmente se depositan 30 embriones/ovocitos por microgota, pero pueden ser cultivados en otras densidades por microgota, según la disponibilidad de embriones/ovocitos (5 a 100 embriones/ovocitos).
Día 3 después de FIV
Evaluación del porcentaje de segmentación embrionaria.
2.- Evaluar al microscopio el porcentaje de segmentación embrionaria, determinando el número de embriones segmentados dividido por el número de embriones/ovocitos depositados inicialmente en cada microgota.
3.- Regresar las cajas X a la incubadora.
Dia 7 - 9 después de FIV
Evaluación final del desarrollo embrionario
1.- Precalentar con anterioridad la platina del microscopio invertido, con el calentador 15 minutos antes del procedimiento
2.- Evaluar el desarrollo embrionaria en etapa de Blastocisto.
3.- Regresar las cajas a la incubadora.
Empacado y Transferencia De Embriones En Fresco
1.- Selección de los embriones en estado de Blastocisto aptos
para transferencia.
2.- Marcado e identificación de las pajillas
3.- Empacado del embrión
1.- Montaje y armado catéter de transferencia del embrión
2.- Colocación funda sanitaria
3.- Transferencia de embrión en fresco al cuerno ipsilateral al CL de la receptora.
PROTOCOLO RESUMIDO PARA PIV DE EMBRIONES
DIA - 2
1.- Alistar Materiales y Equipo
- Cámara de Flujo Laminar
- Microscopio O
- Termo de congelación con las pajillas de los toros a utilizar O
- Termo de descongelación O
- Centrífuga con tres recipientes O
- Tijeras o corta pajillas O
- Embolo para impulsar el semen O
- Cámara de Neubauer O
- Tubos cónicos de centrifugación de 15 ml = 7 O
- Cajas X de 4 recipientes para fertilizar O
- Pipeteador de 1000 microlitros O
- Pipeteador de 25 microlitros O
- Puntas para pipeteador O
- Pipetas estériles (1x5 ml y 1 x 2 ml) O
- Micromanipulador de embriones o jeringa O
- Platina térmica 38°C O
- Cajas de Petri 60 x 15 O
- Toallas de papel absorvente O
2.- Revisar lecturas de temperatura, gases y humedad de la incubadora O
Día - 1
1.- Alistar Medios para Fertilización
- IVF-TALP O
- HEPES-TALP O
- PHE O
- PERCOLL ® 90% O
- KSOM O
- ALCOHOL O
2.- Colocarlos en incubadora O
Día 0 Dia de la Fertilización
- Preparación medios de fertilización 2.5 hs antes de la fertilización O
- Preparación gradientes de Percoll®
- 3 ml 45% O
- 3 ml 90% O
- Tapar bien y colocarlos a 38.5°C O
- Preparar 3 tubos de centrífuga con 15 ml de HEPES-TALP O
- Tapar bien y colocarlos a 38°C O
- Preparar cajas X de 4 recipientes (600 µ/recipiente)
- Preparar 1 tubo de centrífuga con 5 ml de IVF-TALP O
- Dejar la tapa floja y colocar a 38.5°C O
- Preparar 1 tubo de centrífuga con 5 ml de IVF-TALP O
- Tapar bien y colocar a 38°C O
- Colocar PHE en incubadora O
- Entibiar las canastillas de centrífuga en la incubadora O
- Alistar y conectar el descongelador de pajillas O
Preparación y Lavado De Ovocitos
- Organizar Materiales para Lavado y Fertilización de Ovocitos
- Cajas X con HEPES-TAL O
- Instrumentos de busqueda O
- Microscopio esteroescopio O
- Calentador ambiental O
- Tijeras o cortapajillas O
- Embolo para pajillas de semen O
- Microscopio invertido O
- Cajas de Petri O
- Gradilla para tubos. Colocarla en frente del calentador O
- Pipeta Pasteur de plástico estéril O
- Pipeta 25 µl O
- Puntas para pipeta O
Preparación y Lavado Ovocitos
- Transferir 3 grupos de complejos cúmulo-ovocitos de l caja de MMO a una esquina de una caja X con HEPES-TALP O
- Repetir hasta que todos los ovocitos hayan sido colocados en la caja X O
- Transferir grupos de 30 complejos cúmulo-ovocitos maduros a una caja de 4 recipientes con IVF-TALP pre equilibrado O
- Colocar las cajas en la incubadora O
Preparación Del Semen (trabajar frente al calentador)
- Colocar 1 a 3 pajillas de semen en el descongelador O
- Depositar el semen sobre el gradiente de Percoll® O
- Colocar el tubo de Percoll® en una canastilla de centrífuga entibiada O
- Centrifugar por 10 minutos a 1000 x g O
- Colectar la fracción espermática con una pipeta Pasteur O
- Depositar la fracción espermática dentro del tubo de 10 ml con Sp-TALP O
- Colocar el tubo de Sp-TALP dentro de la canastilla de centrífuga entibiada O
- Centrifugar por 5 minutos a 200 x g O
- Retirar el sobrenadante de la fracción espermática O
- Adicionar IVF-TALP O
- Determinar la concentración espermática O
Fertilización
FERNANDEZ A. PROTOCOLO DE FERTILIZACION IN VITRO. Modificado del Protocolo DEl Laboratorio De P.J: Hansen. Instituto De Reproducció Animal e Inseminació Aretificial, Facultad De Ciencias veterinarias, Universidad Central De Venezuela.
- Adicionar 25 µl de semen al recipiente con los ovocitos maduros O
- Adicionar 25 µl de PHE a cada recipiente O
- Colocar las cajas de 4 recipientes en la incubadora para fertilización O
Cultivo Embriones/Ovocitos
- Alistar el medio KSOM entibiado O
- Preparar las cajas con microgotas de 50 µl de KSOM y cubrir con aceite mineral O
- Colocar las cajas en la incubadora para equilibrar por lo menos durante 2 horas O
- Alistar material y equipo para remover embriones/ovocitos de la gota de fertilización O
- Agitador "vortex" O
- Alistar tubos para microcentrífuga esterilizados y taparlos O
- Calentador ambiental frente al microscopio O
- Caja X O
- Microscopio estereoscopio O
- Instrumentos de búsqueda O
- Cronómetro O
- Alistar HEPES-TALP entibiado O
Remoción Embriones/Ovocitos de la gota de fertilización luego de 8-10 hs de Incubación
- Enjuagar el tubo de microcentrífuga con HEPES-TALP O
- Dejar 50 µl para la recolección de los Embriones/Ovocitos O
- Transferir los Embiones/Ovocitos de la gota de fertilización al tubo microcentrífuga O
- Agitar tubo por 5 minutos con el "vortex" frente al calentador O
- Transferir los contenidos del tubo de microcentrífuga al recipiente de la caja X, mediante una pipeta Pasteur. Enjuagar el tubo varias veces O
- Buscarlos Embriones/Ovocitos libres de cúmulo O
- Lavar 2 veces en HEPES-TALP O
- Transferir en grupos de más de 30 a las microgotas de KSOM O
- Colocar la caja de cultivo en la incubadora O
Dia 3
- Precalentar la plataforma del microscopio invertido y cuarto O
- Determinar el grado de segmentación O
Dia 5 Adición SFB (Opcional)
- Colocar el tubo con SFB en la incubadora 1 a 2 horas antes de su adición O
- Precalentar la cámara de flujo laminar O
- Adicionar 5µl de SFB a cada microgota con embriones O
Día 7-9 Selección de Embriones
- Precalentar cámara de flujo laminar O
- Precalentar plataforma microscopio invertido O
- Determinar división y desarrollo de los Embriones (blastocistos) O
- Seleccionar los embriones aptos para transferir.
BIBLIOGRAFIA
ALLER J.F. ALBEIRO R.H. PALMA G.A.
GESTACION CON EMBRIONES PRODUCIDOS IN VITRO A PARTIR DE OVOCITOS RECUPERADOS DE
VACAS OVARIECTOMIZADAS. Arch. med.
vet. v.32 n.1 Valdivia 2000
ASOCEBU.- REVISTA “EL CEBU” N° 379.
MEJORAMIENTO CONTINUO EN LA PRESTACION DE SERVICIO. Marzo – Abril 2011
ASOCEBU. REVISTA “EL
CEBU” N° 391 DINAMICA
DE REGISTROS 2012 SERVICIO
EFICIENTE AL SOCIO. MARZO-ABRIL 2013
BRACKETT
BG. BOUSQUET D. BOICE ML DONAWICK WJ. EVANA JF. DRESSEL MA. NORMAL DEVELOPMENT
FOLLOWING IN VITRO FERTILIZATION EN COW. Biol.
Reprod 1982; 27: 147-158
COLAZO M.G MAPLETOFT R.J. ESTADO ACTUAL
Y APLICACIONES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS. Ciencia Veterinaria
Vol 9 Num 1- 2007 issusu 1515-1883
DAYAN A.- LA APLICACION DE LA ASPIRACION
FOLICULAR Y LA FERTILIZACION IN VITRO EN GANADERIA DE LECHE. Revista Genetica Bovina N° 11 Enero – Febrero 2009
DE LA FUENTE J. REPRODUCCION ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE FIV. Instituto Nacional de Investigación y
Tecnología Agraria y Alimentaria. Universidad de Cordoba Arg. 2012.
DE LOS REYES M. CAPACITACIÓN
ESPERMÁTICA Y REACCIÓN ACROSÓMICA IN VITRO EN BOVINOS. MONOGRAFIAS DE MEDICINA
VETERINARIA U. CHILE. Vol 14 N° 2. 1992
DIEZ C. MUÑOZ M. CAAMAÑOO J.N. BIOTECNOLOGIAS REPRODUCTIVAS: PRODUCCION Y
CRIOPRESERVACION DE EMBRIONESS BOVINOS IN VITRO. TECNOLOGIA
AGROALIMENTARIA N° 8 2008
DIEZ MONFORTE C. MUÑOZ MAAMAÑO J.N. GOMEZ E.. C Estado actual de los
sistemas de producción de embriones en ganado bovino Área de Genética y
Reproducción. Centro de Biotecnología Animal (CBA). SERIDA. Gijón.. ESPAÑA 2013. www.serida.org/publicacionesdetalle.php?id=5572&anyo=
FERNANDEZ A. PROTOCOLO DE FERTILIZACION IN VITRO. Modificado del Protocolo DEl Laboratorio De P.J: Hansen. Instituto De Reproducció Animal e Inseminació Aretificial, Facultad De Ciencias veterinarias, Universidad Central De Venezuela.
FILIPIAK
Y. LAROCCA C.- MANUAL DE
FERTILIZACION IN VITRO EN
BOVINOS UNIVERSIDAD DE
LA REPUBLICA FACULTAD
DE VETERINARIA. URUGUAY -
MARZO 2011.
GALLI C. LAZZARI G. PRACTICAL ASPECTS OF IVM/IVF IN
CATTLE. Animal Reproduction Science
42 371-379
GARCIA J. MARTINEZ J.
IMPLEMENTACION DE UN PROTOCOLO
DE FERTILIZACION IN
VITRO EN BOVINOS
EN EL LABORATORIO
DE REPRODUCCION ANIMAL
DE ZAMORANO. UN. ZAMORANO HONDURAS. 2013
GARDON J.C MATIAS C. GADEA J. FECTO DEL
PROTOCOLO DE PREPARACION DE LOS ESPERMATOZOIDES BOVINOS SOBRE EL PATRON DE
REACCION ACROSOMICA. Anales de Veterinaria de Murcia 19: 15-22 2003
GARDON J.C. GADEA J. EFECTO DEL MEDIO DE
FECUNDACION IN VITRO SOBRE EL PATRON DE REACCION ACROSOMICA EN EL
ESPERMATOZOIDE BOVINO. AN. VET. (MURCIA) 19:
15-22 (2003).
GOMEZ RAMON.-. ASPIRACION FOLICULAR Y
FERTILIZACION IN VITRO (OPU.FIV). APLICACIÓN COMERCIAL. 2013 Jornadas
Veterinarias Internacionales URO. Fac.
Medicina Veterinaria y Zootecnia.
Universidad Del Tolima
GONZALEZ P. MADURACIÓN IN VITRO DE OOCITOS DE GANADO BOVINO. Tesis DOCTORAL
1992
LATTANZI M.L. REGULACIÓN DE LA
MADURACIÓN DE OVOCITOS POR FACTORES PARACRINOS 2010
LORENZO P. MADURACION IN VITRO DE OOCITOS DE GANADO VACUNO. TESIS DOCTORAL
UNIVERSIDAD COMPLUTENCE MADRID 1992
LUCIO A.C RESENDE M.V.
DERNOWSECK-MEIRELLES J.A PERINI A.P OLIVEIRA L.Z. MIGUEL M.C.V. CARMO A.S.
TOMITA S.Y ALVES B.C.A. FAZANO F.A.T. LIMA V.F Assessment
of swim-up and discontinuous density gradient in sperm sex preselection for
bovine embryo production. Arq. Bras. Med. Vet.
Zootec., v.64, n.3, p.525-532, 2012
HERRADON P.G. QUINTELA L.A.
BECERRA J.J. RUBIAL S. FERNANDEZ M. FECUNDACION IN VITRO: UNA
ALTERNATIVA PARA EL MEJORAMIENTO GENETICO EN BOVINOS. Arch. Latinoam. Prod. Anim. Vol.
15 (Supl. 1) 2007.
KRUIP,
T. A. M. AND DEN DAAS, J. H. G. 1997. IN VITRO PRODUCED AND CLONED EMBRYOS:
EFFECTS ON PREGNANCY, PARTURITION AND OFFSPRING. Theriogenology 47:43–52.
MACHADO SA, REICHENBACH HD, WEPERT M, MATOS
LF, WOLF E, GONÇALVES PBD.
Variability in ovum pick up and in vitro embryo production results of
monozygotic twin cows. Acta Scientiae Veterinariae, v.31, p.443, 2003.
MERTON,
J.S., ROOS, A.P.W., MULLAART, E., RUIGH, L., KAAL, L., VOS, P.L.A.M, DIELEMAN,
S.J. 2003. FACTORS AFFECTING OOCYTE QUALITY AND QUANTITY IN COMMERCIAL
APPLICATION OF EMBRYO TECHNOLOGIES IN THE CATTLE BREEDING INDUSTRY. Theriogenology 59: 651-674
MOREIRA J.H. DE ALMEIDA L.S. DE MORAES
A. FERREIRA W. de CARVALHO C.A. de PINO A. Short intervals between
ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but do
not prevent establishment of dominant follicles in the Gyr breed (Bos indicus) of cattle. 2003
MUCCI N. ALLER J. KAISER
G. HOZBOR F. ALBERIO R. PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES BOVINOS:
SUPLEMENTACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO CON SUERO. Arch. Med. Vet 38
N° 2 – 2006
NATALI I. SPERM PREPARATION TECHNIQUES FOR ARTIFICIAL
INSEMINATION- COMPARISON OF SPERM WASHING, SWIM-UP AND DENSITY GRADIENT
CENTRIFUGATION METHODS LIBRO
“ARTIFICIAL INSEMINATION IN FARM ANIMALS” ISNB 978-953-370-312-5 Published June 21 20011 CC BY-NC-SA 3.0 License http//www.intechopen.com/books/artificial-insemination-in-farm-animals.
NAVA H. HERNANDEZ H. ASPIRACION
FOLICULAR TRANSVAGINAL. MANUAL DE GANADERIA DOBLE PROPOSITO. 2005
OLIVERA M. RUIZ T. TARAZONA A. GIRALDO
C. EL ESPERMATOZOIDE DESDE LA EYACULACION HASTA LA FERTILIZACION.
Revista Colombiana De Ciencias Pecuarias.
Vol 19 n° 4 Oct/Dic 2006
PALMA G. 2001 BIOTECNOLOGÍA DE LA
REPRODUCCIÓN. Ed. INTA
PALMA G. PRODUCCION IN VITRO DE
EMBRIONES BOVINOS. 2001
PARRISH J.J. KROGENAASES A. SSUKO-PARRISH J.L. Effect of bovin sperm separation by either swim-up or percoll method on success of in vitro fertilization and early embryonic development. Theriogenology, 44: 859-869. 1995
PARRISH J.J. KROGENAASES A. SSUKO-PARRISH J.L. Effect of bovin sperm separation by either swim-up or percoll method on success of in vitro fertilization and early embryonic development. Theriogenology, 44: 859-869. 1995
PINTO L. ASPIRACION DE
OOCITOS Y PRODUCCION DE EMBRIONES IN VITRO DE VACAS
ESTIMULADAS CON HORMONA FOLICULO ESTIMULANTE (FSH) O GONADOTROPINA CORIONICA
EQUINA (eCG). UNIVERSIDAD ESTATAL DE MARINGA. JULIO 2009
PFEIFER L. M MV, MS; AUGUSTO SCHNEIDER A. MV; MARCIO N CORRÊA M. Factores que afectan la producción in vitro de
embriones bovinos: una revisión. Rev
Colomb Cienc Pecu 2008; 21:109-120
PONTES, J.H.F., NONATO-JUNIOR, I.,
SANCHES, B.V., ERENO-JUNIOR, J.C., UVO, S., BARREIROS, T.R.R., OLIVEIRA, J.A.,
HASLER, J.F., SENEDA,M.M. 2009. COMPARISON OF EMBRYO YIELD AND PREGNANCY RATE BETWEEN
IN VIVO AND IN VITRO METHODS IN THE SAME NELORE (BOS INDICUS) DONOR
COWS. Theriogenology 71:
690-697.
PONTES,
J.H.F., SILVA, K.C.F., BASSO, A.C., FERREIRA, C.R., SANTOS, G.M.G., SANCHES,
B.V., PORCIONATO, J.P.F., VIEIRA, P.H.S., FAIFER, F.S., STERZA, F.A.M., SCHENK,
J.L., SENEDA M,M. 2010 Large-scale in
vitro embryo production and pregnancy rates from Bos taurus, Bos indicus, and
indicus-taurus dairy cows using sexed sperm. Theriogenology 74: 1349-1355.
PONTES,
J.H.F., MELO STERZA, F.A., BASSO, A.C., FERREIRA, C.R., SANCHES, B.V., RUBIN,
K.C.P., SENEDA M.M. 2011. OVUM PICK UP, IN VITRO EMBRYO PRODUCTION, AND
PREGNANCY RATES FROM A LARGE-SCALE COMMERCIAL PROGRAM USING NELORE CATTLE (BOS
INDICUS) DONORS. Theriogenology 75:
1640–1646.
RAFAGNIN M. FERNANDES DA SILVA K.C.
GOMES DOS SANTOS G.M. SENEDA M.M. PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES DE RAZAS
LECHERAS A GRAN ESCALA Spermova 2011 1-:86-91
REA M. CORTEZ J. OLIVARES J. CUBILLO P.
OBTENCION DE EMBRIONES POR MADURACION Y FERTILIZACION IN VITRO DE OOCITOS
BOVINOS. BIOFARBO Vol. IX Dic 2001.
RHEINGANTZ M.G.T., DESCHAMPS J.C., DELLAGOSTIN O.A.,
PIMENTEL A.M., BERNARDI M.L., SAALFELD M.H. PEGORARO L.M.C. Percoll gradient versus swim-up: effect of sperm
preparation method on sex
ratio of in vitro produced bovine embryos.Theriogenology, v.57, n. 1, p. 751,
2002a
RHEINGANTZ
MGT; DESCHAMPS JC; PIMENTEL AM ; PEGORARO LMC. Influência dos métodos do gradiente de
Percoll e do swim-up sobre o desenvolvimento in vitro de embriões bovinos produzidos in vitro. Rev. Bras. Reprod. Anim., v.26, n.4, p.312-316,
2002b
RHEINGANTZ
M.G.T.; PEGORARO L.M.C.; DELLAGOSTIN O.A.; PIMENTEL A.M.; BERNARDI M.L.; DESCHAMPS J.C.
Proporção macho:fêmea de embriões bovinos cultivados na presença ou ausência de
glicose após fiv com espermatozóides selecionados por swim-up ou Gradiente de Percoll. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal
Science, v. 41, p. 32-39, 2004.
RHEINGANTZ, M.G.T.1*; RAMBO,
G.2; SILVA, P.S.2; SILVA, J.J.2; ANGHINONI,
L.B.3; PEGORARO, L.M.C.3 PROPORÇÃO
SEXUAL E DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO APÓS
DIFERENTES PERÍODOS DE INCUBAÇÃO DOS ESPERMATOZÓIDES PELO MÉTODO DO SWIM-UP. XVII
Congresso Estadual de Medicina Veterinária – 25
a 28/10/2006
RIVAS R. BARCELO M. MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA DE LA
REPRODUCCIÓN. Revisado por: Academia de Biologia 2011. Ciudad Juárez,
Chihuahua Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
2011
RODRIGUEZ
C.A TEIXEIRA A.A FERREIRA R.M AYRES H. MANCILLA R.F SOUZA A.H. BARUSELLI P.S.
Effect of fixed-time embryo transfer on reproductive efficiency in
high-producing repeat-breeder Holstein cows. / Animal Reproduction Science 118
(2010) 110–117
SAAVEDRA M. ESTUDIO DE LA COMPOSICION DE
LOS GRANULOS CORTICALES Y DEL
OOLEMA DE OVOCITOS
PORCINOS Y BOVINOS
MADURADOS Y FECUNDADOS
IN VITRO. Universidad De Murcia
20099.
SENEDA,
M.M. 2010. LARGE-SCALE IN VITRO EMBRYO PRODUCTION AND PREGNANCY RATES FROM BOS
TAURUS, BOS INDICUS, AND INDICUS-TAURUS DAIRY COWS USING SEXED
SPERM. Theriogenology 74: 1349-1355. N° 1 ISSN : 2223-9375 91
SENEDA M.M. FERNANDES da SILVA K.C. MAX
M.C. GOMES R.G. LISBOA L.A. FORTES J.H. ASPIRACION DE OVOCITOS POR
ULTRASONOGRAFIA TRANSVAGINAL. CURSO DE FERTILIZACION IN VITRO Y
TRANSFERENCIA EMBRIONARIA. UNAD.
Universidad del Zulia. Venezuela. 2006
SENEDA, M.M., ESPER, C.R.,
GARCIA, J.M, VANTINI, R. RELAÇÃO ENTRE TAMANHO DO FOLÍCULO E ASPIRAÇÃO
FOLICULAR TRANSVAGINAL PARA O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE EMBRIÕES. Arq. Fac. de Vet UFRGS, v.27, n.1,p.
293, 1999.
SEFERTILIDAD 23 INSEMINACION DE LOS OVOCITOS www,sefertilidad.net/docs/biblioteca/.../inseminacionOvocitos.pdf
SILVESTRE M.A. CEBRIAN-SERRANO A. SALVADOR I. PRINCIPIOS Y APLICACIONES DE LA PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES EN GANADO OVINO
VIANA, J.H.M. 2009. MUDANÇAS E TENDÊNCIAS
NO MERCADO DE EMBRIÕES BOVINOS NO BRASIL. O Embrião 42: 5-7.
URREGO R.
TARAZONA A. OLIVERA M. CAMARGO O. SIMPLIFICACION DE LA FERTILIZACION DE
OVOCITOS DURANTE LA PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES BOVINOS. Grupo
INCA-CES. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad CES.
Medellín, Colombia.Grupo de BiotecnologíaAnimal, y DPA/FCA/BIOGEMUniversidad
Nacional de Colombia sede Medellín. Medellín, Colombia.Biogénesis, Facultad de
Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia. 21 julio,
2008).
XU, J., GUO, Z., SU, L., NEDAMBALE,
T.L., ZHANG, J., SCHENK, J., MORENO, J.F., DINNYÉS, J.F., JI, W., TIAN, X.C.,
YANG, X., DU, F. 2006. DEVELOPMENTAL POTENTIAL OF VITRIFIED HOLSTEIN CATTLE
EMBRYOS FERTILIZED IN VITRO WITH SEX-SORTED SPERM. Journal of Dairy Science 89:
2510-2518
WAGTENDONK-de LEEUW A.M. OVUM PICK UP AND IN VITRO
PRODUCTION IN THE BOVINE AFTER USE IN SEVERAL GENERATIONS: A 20015 STATUS. Theriogenology 65 (2006) 914–925
WATANABE, M.R., WATANABE, Y.F., FRANCESCHINI, P.H., DAYAN, A., LOBO,
R.B. Variation in ultrasound guided oocyte recovery in Nellore cows per session
and in vitro embryo production. Theriogenology, v. 51, p. 438-438, 1999.
No hay comentarios:
Publicar un comentario