La Transferencia De Embriones TE es el
proceso mediante el cual los embriones son recolectados de una hembra
“Donadora”, antes de su implantación al útero, para ser transferidos al útero
de otra hembra “Receptora”, de manera que completen su desarrollo gestacional y
den lugar al nacimiento de una cría viable.
Rowson en la Universidad de Cambridge
describió las técnicas quirúrgicas de TE en bovinos con índices de preñez
excelentes, las cuales fueron una herramienta importante en su aplicación
comercial en la primera mitad de los años 70s.
Los protocolos de superovulación, la
elaboración y utilización del medio adecuado, la recolección y transferencia
quirúrgica fueron desarrollados por BETTERIDGE, ADAMS, SEIDEL, FOOTE Y ONUMA, sentando
las bases para la industria de TE en la ganaderia moderna, aunando los
esfuerzos de la investigación y la parte comercial.
Con posterioridad además de los
anteriores, HASLER, ELSDEN, ROW Y DROST, MAPLETOFT, entre otros, implementaron
la técnica no quirúrgica tanto para recolección como para la transferencia de
embriones y difundieron e incrementaron las empresas comerciales de TE,
propagándose a nivel mundial la industria de TE.
Hay que considerar dos aspectos en la
TE, el primero se refiere a la parte investigativa, la cual ha permitido
conocer la fisiología, manejo, clasificación, preservación y manipulación de
las células germinales y el embrión como tal. En este campo se pueden emplear ovocitos y
espermatozoides procedentes de hembras y reproductores de poco valor genético
ya que su manejo y manipulación se mueve desde el punto de vista experimental,
células que pueden obtenerse de animales de granja vivos o de matadero, como de
animales de laboratorio. Además la pérdida de estas células durante los
diferentes procesos no es económicamente significativa.
En la actualidad los estudios que
originalmente fueron planeados
para contestar preguntas básicas de fisiología, están siendo utilizados ahora
para mejorar e incrementar la utilización de la Transferencia de Embriones. Las
nuevas técnicas han agregado una gran cantidad de perspectivas acerca de la
utilización de TE con fines investigativos. La producción de gemelos idénticos,
clones, quimeras, por mencionar algunos, seguramente contribuirá al avance de
estas ciencias. Como se mencionó anteriormente, las técnicas de FIV están
siendo utilizadas para el estudio de la capacidad fertilizante del semen y son
de inmenso valor en el estudio de la competencia del ovocito y el metabolismo
embrionario.(MAPLETOFT)
El segundo aspecto, estrechamente
relacionado con el primero pero diferente en su objetivo final, tiene que ver
con su aplicación, adaptación y manejo desde el punto de vista comercial.
En este aspecto las células germinales
proceden de animales de alto valor genético y por consiguiente de un mayor
valor económico, ya que su finalidad es la producción de una descendencia de
gran calidad, tanto genética como de producción.
Igualmente debe considerarse si la
Transferencia de Embriones se efectuará en una explotación en particular, con
hembras producidas en la finca o dentro de una Central de Reproducción
Asistida, ya que su orientación y desarrollo tienen manejos diferentes, dado el
número de donadoras y receptoras a tratar.
La TE a nivel de finca exige condiciones
óptimas de manejo acompañadas de un proceso
de capacitación técnica del personal a cargo de la manipulación,
alimentación, sanidad y cuidados de la ganadería en general y del programa en
particular, dentro de lo que se ha denominado Buenas Practicas Ganaderas
A nivel de Centrales de Reproducción
Asistida estas deben llenar los más altos estándares de Sanidad Animal, Calidad
Genetica y Seguridad Biológica de tal manera que garanticen embriones de óptima
calidad reflejados en crías excelentes.
APLICACIONES DE
LA TE
La principales aplicaciones de la TE son el mejoramiento genético, al
incrementar la intensidad de la selección y el acortamiento del intervalo
generacional. Esto ha dado lugar al proceso denominado Multiple Ovulación y
Transferencia de Embriones MOET. En
muchos países se han constituido rebaños élite cuyas hembras jóvenes se emplean
para conformar “MOET Juveniles”, mientras que la progenie de machos está siendo seleccionada para la
próxima generación de toros probados para Inseminación Artificial Se ha estimado que, de esta manera, la ganancia
genética puede duplicarse.
Otra aplicación de a TE en programas de
producción es la multiplicación de fenotipos deseables. Así como la IA permitió
la diseminación del potencial genético de los machos, la TE permite la
diseminación del potencial genético de las hembras de alta producción, muchas de
las cuales pueden ser no solamente del mismo origen sino hermanas completas.
Así como la IA ha permitido la producción de toros valiosos, la TE ha
contribuido a la producción de hembras valiosas. (BETTERIDGE)
La Asociación Canadiense de Criadores de Animales desarrolló un
programa para la producción y evaluación de la siguiente generación de toros
donadores para AI. Las vacas donadoras seleccionadas fueron superovuladas e
inseminadas con los mejores toros probados disponibles. La progenie de machos
fue dejada en espera, mientras que las hembras fueron llevadas a producción.
Los toros fueron luego probados a través de la historia productiva de sus
hermanas, en lugar de la historia productiva de sus hijas. De esta manera, fue
posible evaluar genéticamente un toro en 3.5 años, mientras que el estudio de
progenie tradicional tarda 5.5 años. El recorte del intervalo entre
generaciones puede dar lugar a una mayor
ganancia genética general. Además la
exportación y transporte de embriones permite el traslado de progenies
completas en forma de embriones congelados a menor costo. (MAPLETOFT)
TECNICA
DE TRANSFERENCIA DE
EMBRIONES
La técnica de Transferencia de Embriones
consta en general de los siguientes pasos:
·
Selección de la Donadora
·
Selección de la Receptora
·
Superovulacion de la Donadora
·
Fertilización de la Donadora
·
Recolección de los Embriones
·
Evaluación y Clasificación de Embriones
·
Transferencia de los Embriones
·
Criopreservación de los Embriones
SELECCION DE LA DONADORA
Los criterios de selección de animales
donadores son diversos y dependen de la razón por la cual se quiere realizar la
transferencia de embriones, aunque en general las razones están motivadas por
aspectos económicos. Hasta hace poco, la transferencia de embriones solo se
realizaba en animales sumamente valiosos, y los costos asociados tienden a
reducirse, relativamente hablando, en la medida en que el valor económico y
genético aumentan. (MAPLETOFT)
La selección de la vaca donadora debe estar basada en los siguientes criterios principales:
Superioridad Genética
Debe conocerse su pedigrí, índices propios de producción y de su
progenie, así como poseer las mejores
características fenotípicas de la raza o tipo de ganado a producir que den lugar a crías superiores a la media
del hato, especialmente
comparado con las hermanas de la hembra, descendientes del mismo toro. Dentro de este aspecto
debe trabajarse con toros de alta calidad genética, probados y mejorantes.
Al seleccionar donadoras de
razas de carne con genética superior, se deben considerar características
objetivas como la facilidad de parto, producción de leche, peso al destete y al
año y valor de la canal. (RUANE).
Capacidad Reproductiva
La selección de la donadora incluye la historia reproductiva, número y facilidad al parto , habilidad materna, peso al nacimiento y peso al destete de las crías. La donadora potencial debe encontrarse en su mejor edad reproductiva, con un alto nivel de fertilidad y un comportamiento regular en su ciclicidad, en los últimos períodos estrales, dos o menos servicios por concepción.
Dentro de este aspecto es importante además determinar la anatomía y funcionalidad del tracto reproductivo mediante la determinación de la presencia de estructuras ováricas palpables. Se recomienda que esté dentro del PEV establecido en el manejo reproductivo del hato, con un mínimo de 60 días postparto para que se garantice la involución uterina y mostrar una buena ciclicidad. (GONZALEZ)
Es conveniente saber que comportamiento tiene su ciclicidad, si es de una, dos o tres ondas foliculares, en especial si se va a trabajar con embriones frescos o si se realizará mediante inducción y sincronización de la donadora.
Es de extrema inportancia que no se encuentre con un ternero al pie, para evitar el estrés lactacional y cuidados del ternero, logrando así un mayor rendimiento de la madre en este proceso biotecnológico.(PALMA 2001)
Es necesario saber si ha tenido éxito en trasferencias anteriores o partos gemelares, ya que sus hijas muy posiblemente responderán bien al tratamiento y serán buenas donadoras. (MAPLETOFT)
Igualmente al seleccionar la donadora es indispensable que posea un tracto reproductivo desarrollado y funcional, con estructuras ováricas palpables, de buen tamaño y un cuello que permita el paso del catéter de forma fácil. Lo anterior se determina mediante palpación transrectal y cateterización previa del tracto reproductivo y/o el examen ecográfico del mismo.
Por muchos años, se estableció como norma de selección de donadoras que estas debían dejar pasar dos ciclos estrales entre tratamientos de superovulación, con lo cual se podrían efectuar lavados a intervalos de 60 días o más. Sin embargo HASLER y la central genética de Holanda determinaron que es posible superovular las donadoras a intervalos de 40 días por medio de la aplicación de implantes auriculares de progesterona, luego de la administración de prostaglandinas después de la recolección de los embriones, sin tener que esperar que presentaran los dos ciclos. Estos cambios en los protocolos de superovulación incrementaron en un 50% el número de embriones recolectados y congelados por unidad de tiempo, con fines de exportación.
Buena Condición Corporal
Es conveniente saber que comportamiento tiene su ciclicidad, si es de una, dos o tres ondas foliculares, en especial si se va a trabajar con embriones frescos o si se realizará mediante inducción y sincronización de la donadora.
Es de extrema inportancia que no se encuentre con un ternero al pie, para evitar el estrés lactacional y cuidados del ternero, logrando así un mayor rendimiento de la madre en este proceso biotecnológico.(PALMA 2001)
Es necesario saber si ha tenido éxito en trasferencias anteriores o partos gemelares, ya que sus hijas muy posiblemente responderán bien al tratamiento y serán buenas donadoras. (MAPLETOFT)
Igualmente al seleccionar la donadora es indispensable que posea un tracto reproductivo desarrollado y funcional, con estructuras ováricas palpables, de buen tamaño y un cuello que permita el paso del catéter de forma fácil. Lo anterior se determina mediante palpación transrectal y cateterización previa del tracto reproductivo y/o el examen ecográfico del mismo.
Por muchos años, se estableció como norma de selección de donadoras que estas debían dejar pasar dos ciclos estrales entre tratamientos de superovulación, con lo cual se podrían efectuar lavados a intervalos de 60 días o más. Sin embargo HASLER y la central genética de Holanda determinaron que es posible superovular las donadoras a intervalos de 40 días por medio de la aplicación de implantes auriculares de progesterona, luego de la administración de prostaglandinas después de la recolección de los embriones, sin tener que esperar que presentaran los dos ciclos. Estos cambios en los protocolos de superovulación incrementaron en un 50% el número de embriones recolectados y congelados por unidad de tiempo, con fines de exportación.
Buena Condición Corporal
Como se anotó en capítulos anteriores la CC es el reflejo de la
alimentación suministrada. La donadora
debe estar en un rango de CC de 3.0 a 4.0 no cebada. Las
hembras donantes deben ser incluidas en un programa de nutrición balanceada
antes de efectuar el proceso de superovulación, donde se debe procurar administrar
forrajes que brinden al animal los nutrientes necesarios para que se cumplan
las funciones reproductivas, además de la incorporación de productos que proporcionen
al animal adecuados niveles energéticos en la dieta así como suplementos vitamínicos
y minerales (Gómez, 2005).
Buen Manejo Sanitario
La donadora debe encontrarse en un estado sanitario óptimo, libre de enfermedades infecciosas reproductivas, por lo que antes de iniciar un programa de TE a nivel de finca, se recomienda determinar por medio de exámenes de laboratorio específicos, la incidencia de estas afecciones, cuyo costo se verá recompensado luego por un mayor número porcentaje de embriones viables y el éxito del programa. Así mismo la donadora no debe haber presentado retención de placenta en su último parto o secreciones vaginales manifiestas, previas al tratamiento de TE.
Cantidad De Vacas Donadoras
La cantidad de vacas donadoras a
trabajar depende de la respuesta que estas presenten a los protocolos de
superovulación y la cantidad de receptoras disponibles. Cuando se desea
transferir los embriones en fresco es recomendable disponer de entre 10 y 30 receptoras
por donadora, con el fin de poder contar con
el suficiente número de receptoras en celo natural, sincronizadas con el
celo de la donadora y que estén en el día de desarrollo de los embriones
recolectados.
El manejo de criterios de selección estrictos asegura la superioridad genética y un alto nivel de éxito, haciendo que los resultados de la trasferencia sean económicos.
El manejo de criterios de selección estrictos asegura la superioridad genética y un alto nivel de éxito, haciendo que los resultados de la trasferencia sean económicos.
Es imposible predecir cual será la producción de embriones, de una donante primeriza en particular. Si hablamos que hay para MOET una media de 5-6 embriones viables por colecta o lavado, hay que tener presente que un tercio de esas vacas no responderán al tratamiento, un tercio responderá por debajo del promedio y un tercio lo hará por encima del promedio; es bastante variable la producción de embriones entre donantes y entre colectas. Una buena donadora en el primer tratamiento los seguirá siendo en los posteriores. Esta es la gran pregunta que nos hacen los clientes y como no se deben crear falsas expectativas en un trabajo, que además genera mucha ansiedad en todos sus actores, debemos ser claros, de tal manera que todos los involucrados entiendan como es el procedimiento.
SELECCION DE LAS RECEPTORAS
La hembra receptora en los programas de
TE juega un papel importante en los resultados finales, siendo una de las
limitantes en la implementación de estos programas a nivel de fincas, el poder
disponer de un número de hembras
suficientes, aptas para ser transferidas. Por tal razón un número
representativo de hatos ganaderos han redireccionado su explotación a la
producción de hembras receptoras, para ser comercializadas en programas de TE.
Las receptoras deben reunir los
requisitos de sanidad similares a las donadoras, así mismo tener el tamaño
adecuado para permitir el desarrollo normal del feto correspondiente a la raza
del embrión, contar con un canal del parto ancho y nivelado que de facilidades
al nacimiento. Igualmente debe constar con un sistema mamario acorde, que
permita una producción suficiente para el sostenimiento adecuado de la cría
resultante.
CLASIFICACION DEL TRACTO
REPRODUCTIVO
Se recomienda la evaluación del desarrollo y funcionalidad
del tracto reproductivo de la receptora al inicio del programa de TE, mediante
palpación transrectal y examen ecográfico del mismo.
Mediante este examen se determinará la presencia
de alteraciones anatómicas en especial de los cuernos y cuello.
Para que los cuernos uterinos de una receptora se consideren aptos para la transferencia del embrión debe tener un diámetro mayor de 25 mm, con Condición del Tracto Reproductivo 3 a 5. (VELEZ)
Para que los cuernos uterinos de una receptora se consideren aptos para la transferencia del embrión debe tener un diámetro mayor de 25 mm, con Condición del Tracto Reproductivo 3 a 5. (VELEZ)
Al igual que la donante es importante
determinar la facilidad de cateterización del cuello. Así mismo tener una ciclicidad regular, con estructuras desarrolladas y funcionales. Entre mejor calidad del CL mayor ídice de preñez de la receptora. Gráfico 1
Las receptoras deben tener una
ciclicidad regular con estructuras ováricas desarrolladas y funcionales.
Se ha podido determinar que al evaluar
las estructuras ováricas por medio de ecografía
transrectal se observa que un folículo preovulatorio de 1.3 cms da lugar a un
CL de 5 mm con niveles plasmáticos de P4 de 1.22 ng/ml, midiendo a los 14 días
6 mm y niveles de P4 de 2.48 ng/ml. Para un folículo de 1.6 cms, el CL en el
día 7 mide 6 mm y niveles plasmáticos de P4 de 3.05 ng/ml.
Con lo anterior se espera generar unas condiciones
uterinas más favorables para el desarrollo inicial del embrión y la necesidad
de realizar una evaluación previa a la transferencia del embrión a la
receptora, con lo cual permite obtener mejores resultados de la TE.
(VASCONCELOS)
Sin embargo la existencia de un umbral
en los niveles de P4 para evitar que se dé la muerte embrionaria es
controversial, ya que algunos estudios reportan preñeces en receptoras con concentraciones
de P4 <1 ng/ml al momento de la TE. En un estudio realizado por RODRIGUEZ et
al, la media para los valores del
diámetro del CL fue de 19.6 ± 1.8 mm con un coeficiente de variación bajo (9%),
mientras que la media de P4 fue de 3.6 ± 2.6 ng/ml con un coeficiente de
varianza elevado (74%). Además, valores bajos al momento de la transferencia
podría estar reflejando no solo una función lútea anormal sino también
inexactitud en la detección de calores. (RODRIGUEZ)
Como mínimo se debe contar con 10 – 30 receptoras por donante cuando se hace
TE en fresco. No es recomendable utilizar receptoras con más de 2
transferencias negativas. (GOMEZ)
SUPEROVULACION SOV
La superovulación tiene como objetivo el
lograr el mayor número de oocitos a ser fecundados, para producir embriones de
alta calidad que puedan ser transferibles y
progresen en un proceso gestacional que finalmente de lugar al
nacimiento de una cría normal viable. La gran variabilidad en la respuesta a
los tratamientos SOV, el tiempo requerido y esfuerzos necesarios para la
administración de las hormonas empleadas en ellos, así como la predicción
incierta de los resultados, ha hecho que se afecte la difusión de la TE.
De otra parte, los avances logrados en
los últimos años no han podido aumentar de
manera significativa el número de embriones transferibles por
tratamiento SOV. La implementación de protocolos que controlan la emergencia de
la onda folicular y la ovulación aplicados en IATF, han facilitado la SOV de
grupos de donantes, independientemente del período del ciclo estral en que se
encuentren y la IA, sin la necesidad de detectar celos. Sin embargo aún se
presentan inconvenientes que potencialmente pueden dar lugar a errores y afectar la respuesta superovulatoria o aún
peor una ausencia total de respuesta.
Sin embargo, el número promedio de
embriones transferibles en vacas reproductivamente normales se ha mantenido
relativamente constante, tanto en vacas de leche como de carne.
LOONEY reportó un promedio de 11 embriones recolectados con un promedio de 6.2 transferibles en más de 2000 vacas de 14 razas. El 24% de las recolecciones no produjo embriones viables, 64% de las donadoras produjo menos del número promedio de embriones transferibles, y 30% de las recolecciones produjo el 70% de los embriones.
LOONEY reportó un promedio de 11 embriones recolectados con un promedio de 6.2 transferibles en más de 2000 vacas de 14 razas. El 24% de las recolecciones no produjo embriones viables, 64% de las donadoras produjo menos del número promedio de embriones transferibles, y 30% de las recolecciones produjo el 70% de los embriones.
En un estudio retrospectivo que incluyó
1263 donantes, el autor encontró que solamente el 68% de las hembras inducidas
a superovular produjeron embriones transferibles. El 32% restante lo
integraron: 7% sin estimulación ovárica, 7% sin recolección de ovocitos ni
embriones, 17% sin embriones transferibles, 1% donde no se efectuó el lavaje
porque presentaron celo antes de administrársele la prostaglandina F2α durante
el tratamiento hormonal.
Estos promedios pueden compararse con
los datos aportados por la AETA en los cuales el promedio fue de 7.0 en ganado
de carne con más 24.000 donadoras y 6.3 en vacas de leche con más de 15.000
donadoras en 2011. (MAPLETOFT)
Igualmente al evaluar el promedio de
embriones recolectados por cuatro empresas comerciales, este no ha variado en
los últimos 20 años, lo que confirma los datos de la AETA (HASLER)
Los anteriores reportes muestran la gran
variabilidad de la respuesta SOV, creando muchos inconvenientes que afectan la
eficiencia y rentabilidad de los programas de TE.
TIPO DE GONADOTROPINA
En un comienzo en el proceso de
superovulación se utilizaron productos cuyo principio activo era la
Gonadotropina Sérica de Yegua Preñada PMSG, elaborada por medio de la
recolección de sangre de yeguas con 80 – 120 de gestación. En la actualidad se
denomina Gonadotropina Corionica equina –eCG- Estos preparados produjeron una
gran variabilidad de respuesta superovulatoria y sus tasas de recuperación
estuvieron influenciadas negativamente por una excesiva reacción ovulatoria y
una menor sensibilidad de respuesta a tratamientos repetidos
Esta reacción se debe a un período de
persistencia de más de 10 días en la circulación general, produciéndose una
estimulación ovárica continua, folículos anovulatorios, perfiles endocrinos anormales y embriones de baja calidad. (MOOR)
FOLIGON INTERVET. Dosis 1.500 a 3.000 UI IM Día 8 a13 (INTERVET)
Con posterioridad se pudo disponer de productos a base de extractos pituitarios de mayor actividad FSH que LH, puesto que no se pueden obtener puros de una u otra hormona, al administrarse en inyecciones múltiples y al compararlos con la administración de una dosis única de eCG, se logró obtener un mayor número de embriones buenos. Los extractos pituitarios de FSH/LH con bajo contenido de LH han mejorado la respuesta superovulatoria en el ganado. (HASLER)
Aunque en general se considera que es
necesaria la presencia de cierta cantidad de LH en estos preparados para el
éxito de la superovulación, la relación FSH/LH debe ser adecuada para que
favorezcan el desarrollo final de los folículos. Se ha sostenido que una dosis
elevada de extractos pituitarios cuya relación FSH/LH contengan mayor cantidad
de LH, induce una activación prematura del oocito lo que se refleja en una
reducción significativa del
porcentaje de ovocitos
fertilizados y embriones transferibles. (GONZALEZ)
Puesto que el período de vida biológica
de la FSH es de 5 horas o menos, esta debe administrarse dos veces al día para
la inducción de la superovlación.(LOONELY)
Sin embargo estudios recientes han
reportado que la producción de fármacos a base de FSH, mediante técnica
recombinante, inducen una respuesta superovulatoria sin adición de LH exógena y
que la calidad de los embriones puede ser superior. (LOONELY). Además de estos
estudios y otros más recientes que
emplearon FSH recombinante indican que en el futuro se utilizarán
gonadotropinas recombinantes, en la actualidad no se emplean por los altos
costos (ROGAN)
Los tratamientos de SOV generalmente se inician entre los días 8 y 12 del ciclo estral (celo= día 0), sin embargo se ha demostrado una mayor respuesta SOV cuando los tratamientos se inician el día 9 del ciclo estral. Esta observación ha sido sustentada recientemente mediante ecografía al apreciarse que la segunda onda folicular empieza 8.5 días después de la ovulación (día 9.5 del ciclo) en las vacas de tres ondas foliculares y en el día 9.5 post ovulación (10.5 días del ciclo) en vacas de dos ondas foliculares.(GINTHER)
En un sentido práctico, es lógico suponer que las vacas con dos ondas foliculares tienden a tener ciclos más cortos (18-20 días) que las vacas de tres ondas (21-23 días). Por esta razón, la duración del ciclo estral anterior de la donadora puede proporcionar una pista sobre cuál puede ser el mejor día para iniciar el tratamiento SOV. (MAPLETOFT)
Moor y colaboradores sugirieron que tanto la tasa de ovulación como el número de embriones viables producidos son relativamente consistentes dentro de los mismos individuos. Los animales que responden poco en un ensayo los seguirán haciendo en tratamientos subsiguientes, mientras que aquellos animales que respondieron bien inicialmente, lo continúan haciendo de ese modo. Aunque hubo una gran variabilidad entre vacas, se ha visto que el número de folículos es similar en los ovarios de la misma vaca. Además el número de folículos > 1.7 mm de diámetro en un ovario, se correlacionó positivamente con la respuesta siperovulatoria a los tratamientos con gonadotropinas. Mas recientemente, SING et al, demostraron que el número de folículos presentes en el momento de la emergencia de la onda folicular permite predecir la respuesta SOV.
Otros factores relacionados con la
donante en sí misma, se refieren al estado
del desarrollo folicular al
momento de iniciar el tratamiento. Esto tiene mayor importancia cuando en el
proceso de TE se utiliza la detección del celo de la donante para iniciar el
tratamiento.
El
examen ultrasonográfico de los ovarios puede proveer información acerca del
momento más apropiado para iniciar los tratamientos superovulatorios con el fin
de obtener las máximas respuestas de vacas individuales. Durante la parte media
de una onda de desarrollo folicular, el folículo dominante, actuando local o sistemicamente, induce atresia en otros folículos en desarrollo En este sentido
se ha demostrado que el inicio de los tratamientos SOV en presencia de un
folículo dominante resulta en un 40-50% de disminución en la respuesta
superovulatoria (SHAW).
Igualmente
se ha determinado que existe una alta correlación entre el número de folículos
pequeños al momento de iniciar el tratamiento y la respuesta SOV. En conjunto,
estos datos sugieren que se puede esperar una disminución en la respuesta SOV
si está presente un folículo dominante activo al momento de iniciar los
tratamientos, y que la presencia de folículos que están creciendo activamente
en un rango de 3 - 6 mm de diámetro (emergencia de la onda folicular)
puede estar asociada con una mejor respuesta SOV. A través de un solo examen
ultrasonográfico en condiciones de campo es difícil determinar si un folículo
grande es o no funcionalmente dominante y si los folículos pequeños están
creciendo activamente ó están sufriendo atresia Sin embargo, la presencia de
más de seis o siete folículos de 3 - 6 mm de diámetro
8 - 10 días después de la ovulación, en presencia de un folículo
grande, provee suficiente evidencia del inicio de una nueva onda de desarrollo
folicular (SINGH)
La raza es un factor presente en los tratamientos SOV ya que en varios estudios se ha determinado que las vacas Holstein requieren de una mayor proporción de FSH, mientras las vacas Charolaise requieren una mayor proporción de LH para una máxima respuesta SOV.
Los resultados de diferentes trabajos indican que la dosis ideal para vacas Bos Taurus es de 400 mg de Folltropin, para vacas Bos Indicus es de 260 a 320 mg y para novillas 200 a 260 mg, con resultados altamente satisfactorios.
El ganado Bos Indicus responde exageradamente a dosis altas de FSH, encontrándose respuestas satisfactorias con dosis de 133 a 200 mg de Folltropi-V y de 200 a 260 en sus cruces. (BELACUBA)
En cuanto a las dosis empleadas algunos
prefieren dosis uniformes y otros prefieren dosis descendentes de FSH, siendo
la mejor vía de administración la Intra Muscular IM , al compararla con la vía Sub cutánea Sc.
Otro factor no menos importante se
refiere a la calidad del semen, el momento de la IA y la habilidad
del inseminador. Existen evidencias de la existencia de una relación positiva
entre la calidad del semen, el índice
de fertilidad y la calidad embrionaria, por
pare de centros comerciales de reproducción asistida en programas de TE
En términos generales se considera que la
CC influye en la respuesta SOV, de manera similar a lo que se presenta en las
hembras no tratadas, por lo que se asume que el nivel de energía de la ración
influye en las tasas de ovulación y fecundación como en la viabilidad de los
embriones. Hanselmann demostró que la respuesta SOV se correlaciona
positivamente con la CC, observando además que las donantes a campo tuvieron
2.2 embriones transferibles más que la estabuladas
Durante
muchos años se ha tenido como norma que se debe dejar que pasen dos ciclos de
la donadora antes de iniciar un nuevo tratamiento
de SOV.
Así mismo es práctica común administrar PGF2α después de la recolección
a las donadoras que no retornan en celo dentro de las 3 semanas siguientes. En
consecuencia, este protocolo permite que se pueda efectuar recolecciones a
intervalos de 60 días o más. Sin embargo HASLER realizó SOVs a intervalos de 40 días sin necesidad
de tener que esperar a que se presentaran ciclos estrales entre lavados. Este cambio en
el protocolo de SOV incrementó en un 50% el número de embriones recolectados y
congelados por unidad de tiempo, en Holland Genetics.
Al efecto se colocaron implantes auriculares de progesterona y PGF2α,
inmediatamente después del lavado y se observaron los celos. El implante fue
removido a los 10 días y la SOV se
inició a la mitad del ciclo después del siguiente celo. Si no se observaba celo
dentro de las 3 semanas siguientes de remover el implante, se insertaba un
nuevo implante y se iniciaba la SOV 5 días después.
Como se muestra en la Tabla 8 hay disminución en el número promedio de embriones recuperados y congelados (5.5) en una secuencia de 11 SOV repetidas a intervalos promedios de 39.7 días.
De un
total de 264 SOV efectuadas, 47 donadoras (17.8%) no entraron en celo, ni
produjeron embriones congelados, pero fueron incluidas en los datos totales. No
se conoce el porqué estas donadoras no respondieron a las SOV. Hoy en día
muchos profesionales en TE realizan SOVs de las donadoras a un intervalo de 30
a 40 días, de manera rutinaria
PROTOCOLOS SOV
En los años 70s se utilizó la eCG como
hormona superovulatoria. En el Gráfico 2 se muestra el protocolo realizado en el proceso de TE.
El tratamiento tradicional de SOV se
inicia el día 9 o 10 después de detectar el celo, teniendo en cuenta lo anotado anteriormente; además se administra una dosis de PGF2α a las 48 horas de iniciado
el tratamiento SOV con FSH FOLLTROPIN® - PLUSET®, por lo que normalmente se
presenta celo a las 36 a 48 horas, efectuando las inseminaciones, con o
sin manifestaciones de celo, a las 60 y
72 horas luego de la PGF2α. Las vacas
que presenten celo en el momento esperado o un poco antes, van a tener
una respuesta aceptable.
Las vacas que entran en celo un día más
tarde deben inseminarse pero van a producir una baja respuesta (1 a 2 CL). Por
el contrario si los celos se presentan antes de lo previsto (no más de 24 horas),
se puede suspender la administración de
FSH y se efectúa la IA a las 12 y 24 horas de iniciado el estro. (BELACUBA)
Hay divergencias en cuanto al número de Inseminaciones unos
efectúan las inseminaciones a las 12 y 24 horas de iniciado el celo y otros 3
IAs a las 0 – 12 – 24 de iniciado el
celo.
No hay, sin embargo, un protocolo con
una sola inseminación en vacas superovuladas
que haya sido aceptado como superior. (STROUD)
Las receptoras se tratan con PGF2α 18 a
24 horas antes que las donantes, de manera que
presente un estro sincrónico con la donante. Sin embargo hay
profesionales que prefieren detectar celos en el lote de receptoras y utilizar
aquellas que presentaron celo un día antes o un día después de la donante. (BO)
El inicio del tratamiento SOV en los
protocolos convencionales se basa en que la mayoría de las vacas se encuentran
en el comienzo de la segunda onda folicular en el día 10, habiéndose
demostrado que la respuesta SOV es mayor
cuando el tratamiento con FSH se inicia en el momento exacto de la emergencia
folicular, en lugar de 1 o 2 días después.
Teniendo en cuenta lo anterior los
tratamientos SOV convencionales para ser aplicados a un grupo de donantes,
presentan varios inconvenientes:
1.- Requiere de un sistema de detección
de celos eficaz con dedicación casi exclusiva del personal encargado y una
respuesta 100% efectiva a la presincronización de todas las donantes para
determinar el denominado “Celo Base”.
2.- Desde el punto de vista práctico, es
imposible tener a todas las donantes iniciando una onda folicular al mismo
tiempo y por consiguiente en el mismo día elegido para la administración de la
FSH.
3.- El número necesario de receptoras
sería demasiado grande y dependería del número de donantes, haciendo aún más
poco práctico tratar grupos numerosos de donantes, en especial si la TE se efectúa
con embriones en fresco.
Los avances obtenidos sobre la dinámica
folicular y el manejo del ciclo estral, no han permitido lograr un mejoramiento en el número de embriones
transferibles con el tratamiento SOV. Sin
embargo, el desarrollo de
protocolos que facilitan el control de la emergencia folicular y la ovulación
han facilitado la superovulación e IATF de las donadoras, sin necesidad
de detectar celos. Lo anterior constituye un avance importante en la aplicación
comercial de la TE por parte de Centrales de Reproducción Asistida, quienes
pueden efectuar tratamientos SOV, IATF, TE y TETF de forma masiva. Por otra
parte se siguen presentando algunos inconvenientes que dan lugar a una disminución de la respuesta a la SOV, o
peor aún, una ausencia total de respuesta, los cuales deben ser abocados y
solucionados por el profesional.
Con el fin de darle un mejor manejo y
tratar un mayor número de donantes, se adaptaron los protocolos empleados en
IATF para la sincronización de las ondas foliculares y la ovulación, utilizando GnRH o Estradioles
junto con progestágenos en implantes auriculares o DIV, además de PGF2α. Lo anterior ha dado lugar a nuevos protocolos
de TE.
Otro método eficaz para sincronizar el
desarrollo folicular consiste en la aspiración de todos los folículos >5 mm
presentes en los ovarios de la donante,
mediante ecografía transvaginal (OPU), con lo que se produce un aumento
significativo de la FSH circulante y el
reclutamiento de una nueva onda folicular 1.5 días después.
Como la aspiración folicular se realiza en cualquier momento del ciclo, no es necesario sincronizar y observar el celo de las donantes antes de iniciar un proceso de SOV.
Se han empleado la aspiración solamente
del folículo dominante FD, dos días antes de comenzar la SOV, obteniéndose una
respuesta significativamente mayor que las vacas estimuladas en el mismo período
del ciclo, con presencia del FD.
Otros trabajos aspiraron los dos
folículos más grandes, sin embargo la diferencia en la respuesta SOV no ha sido
lo suficientemente significativa en relación con los protocolos de SOV
convencionales. (BELACUBA)
El inconveniente que tiene este método
es que hay que contar con un ecógrafo y personal capacitado para efectuar la
aspiración folicular, lo que hace que se adapte más a Centros de Reproducción,
donde todas las donantes se encuentran concentradas en un solo lugar, al
contrario de la SOV en donantes a nivel de hato.
La capacidad para elegir la inducción de la emergencia de una nueva
onda folicular permite iniciar la SOV sin tener en cuenta el estado del ciclo
estral y elimina la necesidad de detectar celo y esperar 8 a 12 días para
aplicar el tratamiento con FSH.
Como se vio anteriormente el estradiol suprime la liberación de FSH e induce la atresia folicular. Cuando se metaboliza el estradiol aumenta la FSH y se produce la emergencia de la nueva onda folicular, en promedio a los 4 días después del tratamiento. En este momento se inicia la aplicación de la FSH. Por lo tanto, este tratamiento permite el desarrollo de un número variable o cohorte de folículos de 3 a 5 mm que crecen al mismo tiempo.
Diversos experimentos demostraron que el
EB es el estrógeno que suprime el desarrollo folicular de manera más efectiva y
la respuesta superovulatoria es mayor
cuando es combinada con P4 IM en
el mismo momento de la inserción del dispositivo con P4. La dosis de 2,0 a 2,5
mg de EB combinado con 50 mg de P4 administrado por vía IM fueron las dosis más
efectivas con un intervalo entre tratamiento y comienzo de la nueva onda
folicular de 4,0 días. Además con el tratamiento de EB+P4 se obtuvo un número
similar de embriones transferibles que con el tratamiento de 17b-estradiol+P4. El
resultado de la utilización del protocolo EB + P4 fue satisfactorio tanto en
vacas Bos Taurus como Bos indicus. (MAPLETOFT)
Aunque el número de embriones
transferibles no ha aumentado en relación con las hembras superovuladas entre
los días 8 a 12 después del estro, la tasa de fertilización en vacas donadoras
superovuladas, después de los tratamientos con estradiol y progestágenos, fue significativamente mayor que las vacas
control. (BO)
Además, las novillas superestimuladas el
día 4 después de la inserción de un DIV de progesterona sin la administración
de estradiol, tuvieron un porcentaje
bajo de oocitos fertilizados y embriones transferibles, en comparación con las
tratadas con estradiol al momento de insertar el DIV de progesterona. Por el
contrario las tratadas con estradiol y progestágenos presentan el desarrollo de
una nueva onda folicular y en
consecuencia un grupo más uniforme de folículos viables con oocitos competentes
al momento de ser tratados con FSH. Esto demuestra que los folículos
subordinados pueden ser salvados de la
atresia si se hace la aspiración del folículo dominante o tratadas con FSH al
momento de la selección del folículo dominante (ADAMS)
La mayoría de los protocolos de
sincronización de una nueva onda
folicular para SOV comprende la administración de 2.0 – 2.5 mg de BE más
100 o 50 mg de progesterona IM al momento de insertar un DIV.
Las dosis de FSH pueden ser descendentes al igual que en el tratamiento convencional para TE en fresco.
La PGF2α se aplica en el día 6 AM – PM
El DIV
se retira el día 6 PM
La IA se inicia el día 9 AM – PM
y el día 10 AM
Recolección de
embriones día 16
Un nuevo protocolo que involucra el empleo de un diluyente
de liberación lenta de la
FSH, ha aumentado la eficiencia superovulatoria sin incrementar la
producción de embriones. El protocolo utiliza 2 aplicaciones de FSH disuelta en
Acido Hialuronico y lo compara
con el protocolo convencional de
8 aplicaciones de FSH disueltas en solución salina. La producción de embriones
para el protocolo con formulación de liberación lenta fue similar al protocolo
tradicional, resaltándose que las hembras necesitan menos manejo, lo cual
reduce las labores y el estrés de las donantes. (TRIBULO)
Con el
fin de lograr una sicronización de la ovulación y un mayor número de
ovulaciones se ha propuesto el protocolo
que incluye la administración de
eCG, 2 días antes del tratamiento SOV con FSH.
En la Tabla 14 se observan los resultados obtenidos con la
administración de eCG en el día 2 – 3
antes de la SOV, en donde la administración de eCG en el día 2
tuvo la mejor respuesta tanto de
embriones fertilizados como de embriones transferibles. (MENDOZA)
Para
evitar la necesidad de observar celos en las donantes se indujo la ovulación
sincrónica en un protocolo utilizando de DIV y BE con la administración de pLH
(LUTROPIN®) 24 horas después de retirado el DIV. Los tratamientos SOV se
iniciaron 24 horas después de la pLH, momento
esperado de la ovulación y por lo tanto la emergencia de la primera onda
folicular (BO)
Luego de varios experimentos BO et al desarrollaron
un protocolo para IATF en
donadoras Bos Taurus sin la necesidad de detectar celo y sin comprometer los
resultados. En este protocolo la emergencia de la onda folicular fue
sincronizada con BE y un DIV en el día
0. El tratamiento con FSH se inició el día 4. El día 6 se administró PGF2α en
la mañana y en la tarde.
En la mañana del día 7, 24 horas después de la administración de PGF2α, se retiró el DIV. En la mañana del día 8, 24 horas después del retiro del DIV, se administró pLH o GnRH. La IATF se realizó a las 12 y 24 horas después. El dejar la remoción del DIV para la mañana del día 7 produjo un mayor número de oocitos y embriones fertilizados que al removerlo en la tarde del día 6. Desde el punto de vista práctico la IATF de la donadora ha sido útil en la eliminación de tener que detectar celo. (BO).
Sin embargo BARISELLI et al
confirmaron que era preferible la remoción
del DIV en la tarde del día 7 (P 36), seguida de la administración de
pLH o GnRH. Así mismo tuvieron éxito al
realizar una sola dosis de IA con semen de muy alta calidad 16 horas
después. (BARUSELLI).
Estudios recientes han confirmado
que la gran variabilidad individual de respuesta a la SOV está influenciada por
el número de folículos presentes en el ovario de la donadora, sin embargo todos
los esfuerzos e investigaciones en este sentido no se han reflejado en un mayor
número de embriones suministrados por
una donadora. (BO)
La necesidad de inyectar dos
veces por día hace que el tratamiento requiera máxima atención y resulta a veces
muy difícil de aplicar en algunas explotaciones, reduciendo aún más la
posibilidad de su utilización masiva.
Además, cuando el tratamiento es aplicado incorrectamente las vacas no
responden, o si se las trata bruscamente puede causar estrés en algunas
donantes, con la consiguiente disminución de la respuesta SOV.
Con el fin de reducir el estrés
de manejo y la influencia que este tiene sobre la respuesta SOV se diseñaron
varios experimentos en donde se administró una dosis única de Folltropin®,
comparando su efecto con la administración de dosis múltiples descendentes.
Esta dosis única se diluyo en un agente de liberación
lenta, SRF® de Bioniche Animal Health, siendo la dilución de mejor respuesta la del 25%, siendo la dosis SOV de
mejor respuesta de 400 mg de Folltropin®
En el Día 0, todas las vacas recibieron 5 mg de 17β-estradiol, 50 mg de progesterona y un dispositivo Cue-Mate. El Día 4, las vacas fueron superestimuladas con dos tratamientos: las vacas del Grupo Control recibieron FolltropinV en dosis decrecientes por vía im cada 12 h durante 4 días, mientras que las vacas del Grupo Dosis Simple recibieron una dosis única de Folltropin-V diluida en 10 ml de SRF que fue aplicada por vía im en la tabla del cuello.
En la mañana y la tarde del Día 6, todas las vacas recibieron PGF2α y se retiró el Cue-Mate en la tarde del Día 6.
En la mañana del Día 8 las vacas recibieron 12,5 mg de pLH y fueron inseminadas
12 y 24 horas más tarde (Día 9). Las vacas que mostraron celo en la tarde del Día
7, fueron inseminadas en el momento de la pLH y 12 h más tarde. Se recolectaron
los embriones en el Día 15 y fueron clasificados siguiendo las normas de la
IETS. En el Día de la recolección, las donantes recibieron PGF2α, para ser
nuevamente tratadas entre 13 y 20 días después (30 a 40 días de intervalo entre
recolecciones).
Este protocolo tuvo una respuesta
SOV similar a la obtenida con el protocolo convencional de 8 dosis cada 12 horas por 4 días. No hubo
efectos adversos del tratamiento sobre el crecimiento folicular, el momento de la ovulación y la
calidad embrionaria, no obstante siendo viscosa la dilución de SRF empleada, la
cual requiere de cuidados especiales. (BO-TRIBULO
2011)
Con el fin de reducir las labores en el tratamiento superovulatorio mediante la aplicación dos veces al día vía IM de FSH durante 3 a 4 días, HIRAIZUMI et al, investigaron la respuesta SOV en vacas Japanese Black con una dosis Subcutánea de FSHp en la región del cuello, en dosis diferentes de 20 Unidades Armour (UA), Tratamiento 1, y 30 Unidades Armour (UA) Tratamiento 2, disueltas cada una en 10 ml o 50 ml de solución salina, en comparación con el grupo control que recibieron 20 UA IM dos veces al día en dosis decrecientes por más de 3 días
En ambos tratamiento 1 y 2 no hubo diferencias significativas entre los tratamientos. A las 10 horas después de la administración, la concentración de FSHp disminuyó y no hubo diferencias entre los tres tratamientos. estos resultados sugieren que el aumento del volumen de solución salina o la dosis de FSHp no afectó su comportamiento de absorción al ser admnistrada en dosis única Subcutánea. Por lo tanto la administración Sc de FSHp a dosis de 20 a 30 UA disueltas en 10 o 50 ml de solución salina, es capaz de inducir al respuesta superovulatoria comparable con la obtenida por la administración IN dos veces al día, en vacas Japanese Black.
El siguiente protocolo muestra como se puede SOV vacas cada 30 días, sin necesidad de detectar celos y sin comprometer los resultados.
Día 0 - Insertar CIDR 17 B Estradiol - 5 mg + 100 mg de progesterona
Dia 4 - 80 mg de Folltropin-V dos veces al día vía IM
Día 5 - 60 mg Folltropin-V dos veces al día vía IM
Día 6 - AM - 40 mg Folltropin-V vía IM e inyección de PGF2
Día 6 - PM - 40 mg Folltropin-V vïa IM; remover el CIDR
Día 7 - 20 mg Folltropin-V dos veces el día vía IM
Día 8 - PM - IA
Día 9 - AM - IA
Día 15 - Recolección de Embriones, Congelamiento o Transferencia; PGF2
Día 30 - Insertar CIDR + 17 B estradiol 5 mg + 100 mg de progesterona. (MAPLETOF)
Este estudio ha demostrado que el control exógeno del inicio de la onda folicular ofrece la ventaja de poder iniciar los tratamientos SOVs en un momento óptimo para el reclutamiento de folículos, independientemente del estado de ciclo estral. El protocolo es práctico, fácil de seguir por el personal de la finca y lo más importante, elimina la necesidad de detectar tanto los celos como la ovulación y la consecuente espera de 8 - 12 días para poder iniciar el tratamiento con gonadotropinas.
Este estudio ha demostrado que el control exógeno del inicio de la onda folicular ofrece la ventaja de poder iniciar los tratamientos SOVs en un momento óptimo para el reclutamiento de folículos, independientemente del estado de ciclo estral. El protocolo es práctico, fácil de seguir por el personal de la finca y lo más importante, elimina la necesidad de detectar tanto los celos como la ovulación y la consecuente espera de 8 - 12 días para poder iniciar el tratamiento con gonadotropinas.
En la Tabla 15 se muestra una hoja de cálculo en donde al tomar como base la fecha del día de inicio del protocolo de TE o Dia 0, se pueden programar las distintas actividades a realizar, tanto en la donadora como en la receptora. (VEJARANO)
El Gráfico 11 muestra las distintas labores a realizar durante un protocolo completo de TE en fresco y la sincronización que debe haber entre el inicio del tratamiento de la donadora y la receptora, con IATF para que el útero de la receptora se encuentre en el momento correspondiente a la edad de desarrollo de los embriones a transferir, por lo que el protocolo en la receptora se inicia dos días antes del protocolo para la donante y se efectúa el lavado o recolección de embriones en el día 15 del protocolo de TE.
Con lo expuesto se puede concluir
que existe una gran variedad y multiplicidad de protocolos de SOV en el TE, por
lo que en la utilización de uno u otro juega un gran papel el criterio y la
experiencia del Profesional.
RECOLECCION Y LAVADO DE EMBRIONES
Luego
de su fertilización en la ampolla oviductal, los embriones llegan al útero
después del día 5, sin embargo más del 10% puede permanecer en el oviducto al
menos hasta el día 8, encontrándose en este día en la punta del cuerno.
A pesar que el lavado no quirúrgico
reemplazó mundialmente la recuperación quirúrgica de embriones vía incisión del
flanco izquierdo, esta técnica fue ampliamente utilizada por los profesionales
a comienzo de los 80s. Es de anotar que en Colombia el Dr Gustavo Jaramillo fue
el pionero de la técnica de
transferencia quirúrgica en bovinos en el año 1976 y con posterioridad en la TE no quirúrgica.
El medio de lavado como el de
mantenimiento debe semejarse física y químicamente al medio interno del útero
al momento de su recolección. El pH debe mantenerse en 7.5 ± o.5 con una osmolaridad de 285 a 300
miliosmoles (mMol). Algunos Profesionales y Centrales prefieren preparar sus
propios medios de lavado y mantenimiento, otros utilizan preparados comerciales
listos para su empleo.
El medio de lavado más empleado
es el Fosfato Buffer Salino –PBS- Dulbecco, adicionado con Suero Fetal Bovino
–SFB- inactivado con calor y una solución adecuada de
antibióticos/antimicóticos. Igualmente puede emplearse Albúmina Sérica
Bovina –ASB-. Esta solución debe
prepararse y mantenerse congelada en pequeñas dosis individuales, para
facilitar su manejo. El medio de recolección contiene de 1 a 2 % de SFB y el de
mantenimiento normalmente contiene 10% de SFB, pudiéndose almacenar en jeringas
de almacenamiento, las cuales deben tener émbolos plásticos, pues se ha
demostrado que los émbolos de caucho de las jeringas desechables son tóxicos
para los embriones. (MAPLETOFT)
En la actualidad se dispone
comercialmente de diferentes medios de
recolección y mantenimiento como TCM-199, HMS F-1, HAM-F10, VIGRO®,
BioLife TM Advantage, Embriocare ®, DMEM
–Dulbecco Modificado Medio Eagle®, etc. Comúnmente, los
embriones son mantenidos en el mismo medio ó uno similar al que fue usado para
la recolección. Algunos de estos medios de recolección, mantenimiento y
congelación no contienen preparados con productos de origen animal y que por lo
tanto no requieren refrigeración, contribuyendo además a mejorar la
bioseguridad.
En
un comienzo la recolección de embriones se efectuó mediante técnica quirúrgica.
Posteriormente ELSDEN y HASLER, entre otros, desarrollaron el método no quirúrgico mediante el empleo de un catéter de Foley
adaptado para el efecto. Este método evolucionó rápidamente con los trabajos
realizados por la Universidad de Wisconsin y Utrech, utilizando catéteres
siliconados de longitud y tamaño variable.
El
catéter de Rush es de dos vías y tiene un
mayor espacio entre la punta y el balón,
además de poseer una longitud de 67 cm y un diámetro externo de 14 a 18
cm, cuatro orificios, un espacio entre la punta y el globo de 5.5 cm, y aseguramiento
mediante enroscado. Su extensión permite que pueda ser utilizado en vacas con diferentes tamaños del útero y que puedan ser introducidos a distancias distintas dentro del cuerno uterino. Sin embargo, hay variedad de proveedores de equipos que suministran otro tipo de catéteres que son modificaciones del catéter de Rush.
mediante enroscado. Su extensión permite que pueda ser utilizado en vacas con diferentes tamaños del útero y que puedan ser introducidos a distancias distintas dentro del cuerno uterino. Sin embargo, hay variedad de proveedores de equipos que suministran otro tipo de catéteres que son modificaciones del catéter de Rush.
Actualmente es la técnica empleada por todos los Profesionales de Reproducción
Asistida, dada su facilidad de ejecución.
Existe
una gran variedad de técnicas de lavado con porcentajes de éxito comparables.
Como requisito previo debe realizarse una anestesia epidural baja, con la
administración de 2 a 3 ml de lidocaína o xiloxaina al 2%.
La inyección debe aplicarse lentamente y sin
resistencia. A pesar que la relajación de la cola es inmediata, la acción sobre
el recto y el esfínter del ano requiere aproximadamente 10 minutos.
Por otra
parte puede producirse un efecto anestésico incompleto, con una buena anestesia
de la cola (flaccidez) pero insuficiente anestesia de los órganos de internos,
causado por lo general por una incorrecta administración. En ese caso deberá
suplementarse o repetirse la dosis.
Es importante
destacar que una insuficiente anestesia epidural puede
ocasionar el fracaso del lavaje en animales indóciles, en estos casos se
recomienda la administración controlada de tranquilizantes como la Ketamina o
la Xilacina según el peso.
En algunos casos es
posible la aspiración de aire dentro del recto, lo que constituye una
complicación pues este pierde sensibilidad y capacidad de expulsión del aire,
para solucionar este inconveniente se puede hacer retracción suave del útero al
momento de efectuar la evacuación de la materia fecal.
La
técnica de lavado y recolección de embriones consiste en la introducción del
catéter con un estilete acerado, que le
da la rigides necesaria para su paso a través del cérvix.
Otros técnicos
prefieren colocarlo en la parte media de cada cuerno o aún más adentro, efectuando
el lavado individual de cada uno.
Los
puntos de referencia para el avance del catéter son el ligamento intercornual,
la curvatura uterina y el extremo anterior del cuerno. Una vez se alcanza la
posición deseada se retira el mandril y se procede a insuflar el balón con aire
o medio. El volumen depende de la edad y tamaño del animal, siendo el operador
quien determine finalmente por palpación la cantidad a administrar.
Si
el balón se encuentra en el extremo anterior del cuerno y este no se distiende
al inyectar la solución, significa que la pared del útero se desgarró o fue
perforada con la punta del catéter, el medio es expulsado en la cavidad
abdominal, recuperándose solo un volumen reducido teñido de sangre.
En
resumen existen dos sistemas de lavado o recolección de embriones, el de flujo
continuo, con un sistema de circuito cerrado y la interrumpida la cual se
realiza con jeringa.
Cada
técnica tiene sus ventajas y desventajas, pudiéndose combinar ambas por parte del profesional, según su criterio y experiencia.
En el flujo continuo el medio de lavado se introduce dentro del útero por gravedad, mientras otros utilizan un sistema de circuito cerrado de tres vías y jeringas que facilitan la introducción de pequeños volúmenes de medio, los cuales son recolectados en filtros que permiten su separación a medida que fluye el medio de lavado, equipos que son desechables.
El
volumen de medio a inyectar debe ser regulada cuidadosamente por el operador,
de manera que se introduzca la cantidad suficiente para que se produzca dentro
del útero la presión de retorno sin que su exceso provoque dolor. Generalmente
se administran 30 a 50 ml, siendo el volumen total de 500 a 700 ml por cada
cuerno, a criterio del profesional.
La
recuperación optima del medio no es inferior al 90% del volumen inyectado, sin
embargo se afirma que la mayor parte de embriones y oocitos se obtienen después
de recuperar 200 ml.
Una vez terminado el lavado se repite la misma operación en el otro cuerno. De acuerdo
a la flexibilidad del catéter es posible cambiarlo de cuerno sin sacarlo del tracto genital, para
lo cual luego de desinfla el balón y se
retira hasta el cérvix e introducir lentamente el mandril para luego ser
dirigido al otro cuerno.
El
sistema de jeringa permite la introducción de una pequeña cantidad de medio
que produce un torbellino interno,
con lo que se movilizan los embriones, siendo luego extraído con
la misma jeringa de manera alterna y posteriormente
pasarlo por los filtros para su
separación y posterior clasificación.
Una
guía para determinar la cantidad de embriones posibles de recuperar, es la de
contar el número de CLs presentes en
cada ovario, ya que correspondería con el número de ovulaciones. Sin embargo no
siempre sucede esto y la razón no se
conoce con exactitud, dándose algunas explicaciones como oocitos no fertilizados,
embriones retardados o degenerados que quedan atrapados en el oviducto o ser
reabsorbidos, falta de experiencia o problemas de lavado aún en grupos
experimentados.
Completado el proceso de recolección,
se efectúa el vertimiento del contenido de los filtros en una caja de Petri,
así como una irrigación y lavado del filtro y el catéter para realizar un
barrido de los mismos
EVALUACION DE EMBRIONES
La evaluación de los embriones debe realizarse mediante examen microscópico de la caja de Petri, sobre una base cuadriculada, que facilita laobservación ordenada con aumentos 50 - 100X.
Todas las estructuras encontradas son trasferidas a otra caja para su selección individual y conformar un grupo final para clasificación.
Cada uno de los embriones es colocado en cajas de selección y almacenamiento. Aunque los embriones son trasferidos luego de su selcción, es posible conservarlos por algunas horas a temperatura ambiente en el medio de mantenimiento, el cual es más enriquecido que el de recolección.
EVALUACION DEL EMBRION
Los puntos a tener en cuenta al evaluar los embriones son:
ESFERIFICIDAD.- La estructura es esférica, cualquier variación se considera u colapso y por consiguiente de menor calidad.
ESTRUCTURAS VISIBLES.- En sus estados iniciales las blastómeras son bien definidas, mientras que a medida que son más numerosas son menos difusas debido a la aglomeración de las mismas.
REGULARIDAD.- Se aprecian estructuras bien definidas sin deformaciones que indiquen su degeneración o muerte.
OPACIDAD.- Los embriones viables poseen refringencia, los degenerados son opacos y en su mayoría son siempre ovocitos. La refringencia del embrión es debida a la brillantez de la membrana plasmática del embrión.
ZONA PELUCIDA INTACTA. La ZP no debe ser uniforme, no mostrar alteración alguna en su contorno, ni presentar áreas con perdida de solución de continuidad, lo cual es manifestación de estar afectada por microorganismos. Igualmente debe estar libre de detritus en su superficie.
El diámetro promedio del embrión bovino es de 150 a 190 milimicras, incluyendo el espesor de la ZP de 12 a 15 milimicras. Su tamaño permanece sin cambios desde el estado de una célula hasta el estado de Blastocisto.
El embrión ideal debe ser compacto y esférico. Las blastómeras deben tener tamaño. color y apariencia similares, con un contorno uniforme. Su contenido debe ser fijo, sin granulaciones ni vacuolas en el citoplasma. El espacio perivitelino debe estar limpio sin presencia de residuos celulares.
ESTADOS DE DESARROLLO EMBRIONARIO
MORULA TEMPRANA.- Masa de al menos de 16 blastómeras individuales, fáciles de distinguir una de otra, la cual ocupa la mayor parte del espacio perivitelino.
MORULA COMPACTA.- Blastómeras agrupadas formando una masa uniforme que ocupa el 60 a 70% del espacio perivitelino.
BLASTOCISTO TEMPRANO.-
Las blastómeras se encuentran organizadas y distendidas formando un anillo que ocupa la mayor parte del espacio perivitelino, con una cavidad o "blastocele".
BLASTOCISTO
Dentro de la ZP se observan cambios diferenciados de la capa externa del embrión, el "Trofoblasto" y la "Masa Celular Interna" MCI, más oscura y compacta. El blastocele es más notorio y el embrión ocupa todo el espacio perivitelino.
BLASTOCISTO EXPANDIDO O TARDIO
Se presenta un adelgazamiento de la ZP, aumentando notablemente el diámetro general del embrión.
BLASTOCISTO ECLOSIONADO
Los embriones en este estado inician la pérdida de la ZP, la cual se rompe y permite la extrusión del embrión, por lo cual se puede observar la salida del mismo por la ruptura, dejandolo completamente libre, siendo evidente la delimitación del blastocele y la masa celular interna. Su identificación puede ser difícil a menos que se reexpandan.
CALIDAD EMBRIONARIA
EXCELENTE.- embrión esférico, simétrico, con células de tamaño, color y apariencia uniformes, contenido fijo y ZP intacta.
BUENO.- Presentan pequeñas imperfecciones como blastómeras extruidas, de menor tamaño, forma irregular con algunas vesículas.
REGULAR.- Los defectos son más definidos, con blastómeras extruidas, vesículas y células degeneradas.
MALO.- Las blastómeras extruidas son numerosas así como las células degeneradas de diferentes tamaños, vesículas grandes y numerosas, aunque aparentemente se ve una masa embrionaria visible. Generalmente no son de calidad transferible.
CODIGOS DE CALIDAD RECOMENDABLE
Los códigos establecidos por la IETS para clasificar embriones se encuentran entre "1 a 4".
Código 1.- Excelente o Bueno. Embrones simétricos y esféricos, con masa embrionaria constituida por blastómeras de tamaño y densidad uniforme. Se encuentran en estado correspondiente al de la edad de recolección. Se pueden observar irregularidades menores con al menos el 85% de masa celular viable e intacta. El material extruido en el espacio perivitelino no mayor del 10%. La ZP debe ser lisa y no presentar superficies cóncavas o planas que puedan ocasionar que el embrión se adhiera a las pajillas o cajas de Petri.
Código 2.- Regular. Alteraciones oderadas en la forma, tamaño, color y densidad de la masa embrionaria y de las células individuales. Al menos el 50% de la masa embrionaria debe ser viable e intacta.
Código 3.- Malo. Marcas irregulares en la masa embrionaria, tamaño, color y densidad de las células. Un 25% de la masa embrionaria visible e intacta.
Código 4.- Degenerado. Embriones con masa indefinida o colapsada.
Estos embriones junto con los ovocitos no son viables ni transferibles.
En una misma recolección es posible encontrar una considerable variedad de estados de desarrollo embrionario en un momento determinado. El día 7 después ee la IA pueden encontrarse mórulas y blastocistos en eclosión. Al mismo tiempo, se pueden encontrar embriones de excelente calidad, embriones no fertilizados y degenerados. El hecho de encontrar grandes variaciones en la calidad y estado de desarrollo embrionario generalmente indica que los embriones con apariencia normal pueden estar sujetos a estrés o alterados y por consiguiente los índices de preñez no son satisfactorios. Los embriones de excelente y buena calidad, en estados de desarrollo de mórula compacta a blastocisto producen índices de preñez más altos, aún después de haber sido congelados. Los embriones regulares, de baja calidad o malos producen índices de preñez bajos después de congelados, por lo que deben ser trasferidos en fresco. Es recomendable escoger el estado de desarrollo del embrión acorde con la sincronía de la receptora. Los embriones clasificados como regulares o pobres tienen mayor posibilidad de sobrevivir si son transferidos a las receptoras con mejor sincronía.
En una misma recolección es posible encontrar una considerable variedad de estados de desarrollo embrionario en un momento determinado. El día 7 después ee la IA pueden encontrarse mórulas y blastocistos en eclosión. Al mismo tiempo, se pueden encontrar embriones de excelente calidad, embriones no fertilizados y degenerados. El hecho de encontrar grandes variaciones en la calidad y estado de desarrollo embrionario generalmente indica que los embriones con apariencia normal pueden estar sujetos a estrés o alterados y por consiguiente los índices de preñez no son satisfactorios. Los embriones de excelente y buena calidad, en estados de desarrollo de mórula compacta a blastocisto producen índices de preñez más altos, aún después de haber sido congelados. Los embriones regulares, de baja calidad o malos producen índices de preñez bajos después de congelados, por lo que deben ser trasferidos en fresco. Es recomendable escoger el estado de desarrollo del embrión acorde con la sincronía de la receptora. Los embriones clasificados como regulares o pobres tienen mayor posibilidad de sobrevivir si son transferidos a las receptoras con mejor sincronía.
Una vez
seleccionados los embriones a trasferir se deben efectuar varios lavados, con
el fin de eliminar moco o células
adheridas a la ZP, de tal manera que se aíslen en un estado de limpieza óptimo.
Para el efecto se
realiza la siguiente serie de lavados:
5 lavados con PBS
(1/100 volumen de los embriones y no más de 10 embriones).
2 lavados con tripsina al 0.2% por 30
a 60 segundos.
5 lavados con PBS.
Luego de llevar a
cabo los lavados, se procede al empacado del embrión en la pajilla de
trasferencia o congelación según el caso. Al efecto se coloca la pajilla en el
catéter por el extremo con el tapón blanco hacia abajo y se coloca el
dispositivo para facilitar la aspiración del embrión colocándolos en la
gradilla según el número de embriones a trasferir.
TRASFERENCIA DEL
EMBRION
Las primeras trasferencias en los años 70s se llevaron a cabo por el método quirúrgico, mediante incisión de la fosa paralumbar correspondiente al mismo lado en que se encuentra el CL, identificado con anterioridad. Se exponía la punta del cuerno uterino a través de la incisión y se puncionaba la pared del útero con un estilete romo. El embrión previamente seleccionado y aspirado en una pipeta Pasteur o catéter N° 20, unido a una jeringa de 1 ml, se depositaba en la punta del cuerno a través de la punción previamente realizada. (HASLER)
Actualmente la TE se efectúa por la técnica no quirúrgica, para lo cual se utilizan varios tipos de catéteres, unos con mandril y otros rígidos con adaptadores para la pajilla.
Con la hembra asegurada en el brete, se
procede al lavado y desinfección del tren posterior y los genitales externos.
Luego se aplica una anestesia epidural baja, con el fin de relajar el cuello y
facilitar la introducción del catéter. Enseguida se arma la pistola con la
pajilla del embrión a transferir.
El catéter se introduce en la vagina, de
la misma manera a como se procede en la IA, hasta llegar a la parte anterior del cuerno
uterino, para dirigirlo posteriormente a la punta del cuerno ipsilateral al CL, previamente identificado.
En la Tabla 16 se presenta los resultados relacionados por el Dr. Gabriel Velez junto con otros profesionales, que dan una idea y pueden servir de guía a seguir en el ejercicio de la Reproducción Asistida.
Las receptoras
sincronizadas con PGF2µ deben tratarse 12 a 24 horas antes de la donadora, ya
que la PGF2µ induce la presentación del celo 60 a 72 horas de su aplicación
(KASTELIC)
El éxito de los programas de sincronización de celos depende del entendimiento de las siguientes áreas:
1) La fisiología del ciclo estral bovino (descrito anteriormente),
2) Agentes farmacológicos y sus efectos sobre el ciclo estral de las vacas.
3) Factores de manejo del rebaño que puedan reducir el anestro e incrementar las tasas de concepción. (MAPLETOF)
SINCRONIZACION DONADORA
RECEPTORA
Desde la iniciación
del TE se ha hecho énfasis en la
necesidad de lograr una sincronización entre la edad cíclica del útero de la receptora con la edad de
desarrollo del embrión, tanto para su transferencia en fresco como de embriones congelados.
Con el manejo del
ciclo estral, mediante protocolos hormonales para IATF se ha conseguido este
objetivo, sin embargo hay dos tendencias bien
definidas.
La primera,
considerada tradicional, consiste en detectar el celo de un grupo de receptoras y utilizar aquellas que
presentan celo con una diferencia
de ± 1 día con el celo de referencia de la donadora e inicio del protocolo
elegido de TE.
Hay que considerar
que en los primeros 7 días del ciclo estral el tamaño del CL puede aumentar de
9.4 mm a 21.9 mm y que con esto aumenta
la tasa de concepción.
En el Gráfico 12 se aprecia que los porcentajes de
concepción en los días 7-8-9 corresponden al 47%-55% y 43% respectivamente. Es
claro que el mejor día para efectuar la transferencia de los embriones es el día 8 con una preñez
del 80% de las receptoras y un porcentaje de concepciones del 55% en este día.
Este dato es importante cuando se manejan volúmenes altos de hembras. (VELEZ)
Un segundo factor de selección al momento de la transferencia es la presencia y el tamaño del cuerpo en la receptora. Según Oyuela 2009 el porcentaje de preñez para CL en tres Centrales de Asistencia Reproductiva fueron de 28% para CL1 39% para CL2 y CL3. Gráfico ---
Lo anterior ha sido corroborado por
otros trabajos (BARUSELLI – SPELL) y de hecho, el tamaño del CL y la
concentración de P4 al momento de la TE es una variable considerada
determinante para el establecimiento de la preñez. Por esta razón, la medición
del CL es un parámetro de selección de las receptoras.
Al mismo tiempo que se determina el
tamaño del CL mediante palpación y
ecografía, se determina el ovario en que
se encuentra, ya sea el derecho o el izquierdo, lo cual es importante para que
al momento de realizar la transferencia esta se efectúe en el cuerno
ipsilateral al CL del ovario de la receptora.
De otra parte hay que tener en
cuenta que al momento de seleccionar las receptoras el día de la transferencia
hay una gran variación en cuanto a su clasificación como
aptas y no aptas. Según VELEZ un 25% de las receptoras sincronizadas no se van
a poder utilizar en la transferencia.
La
administración de complejos vitamínicos
y minerales en las
receptoras dentro de un programa de
mejoramiento y preparación del grupo de
receptoras previo a su inclusión en
protocolos de TE, aumenta la capacidad y
el porcentaje de pegamiento de embriones.
Dentro
de los productos comerciales se encuentran el Kirofosfan®, Betaferol®,
Calfosvit®
Debido a la implementación de los
protocolos de IATF en la TE, se ha
podido adelantar la Trasferencia de Embriones a Tiempo Fijo TETF, en donde es
posible eliminar la necesidad de detectar celos en las receptoras, protocolos
que fueron expuestos anteriormente.
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