Este objetivo se ha logrado mediante distintas técnicas de criopreservación, que mantienen la viabilidad y funcionalidad celular a temperaturas bajas. La criobiología se refiere a entender los efectos de las temperaturas bajas sobre los sistemas celulares ya que el tiempo biológico es una consecuencia de determinadas reacciones bioquimicas, las cuales se hacen más lentas mediante la aplicación del frío y en consecuencia se prolonga su tiempo biológico, puesto que se hacen más lentas estas reacciones
Sin
embargo, este no es un proceso exento de problemas ya que puede inducir
variaciones extremas en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas las
cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada
interacción célula-célula inherente en las células a criopreservar. La criopreservación está influida por un elevado número de variables, de forma que ninguna aproximación que contemple sólo uno o parte de los aspectos implicados garantiza una eficacia total.
La criopreservación es el proceso en el cual las células son congeladas a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80°C y 196°C (punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de la célula u organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquimicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.
Cada tipo celular debe ser congelado
conociendo el perfil biofísico de la célula, el cual dictará mediante ensayos
de permeabilidad y volumen osmóticamente inactivo con diferentes criopreservantes
y/o soluciones crioprotectoras (mezcla de crioprotectores penetrantes y no
penetrantes) junto con el mejor
protocolo de criopreservación de esa célula. Es importante mantener un sistema de
seguridad, que permita la continuidad en nitrógeno líquido y ensayos de control
de calidad por medio de pruebas de viabilidad.
La estructura y composición de las membranas plasmáticas
determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los
procesos de criopreservación, su comportamiento durante la congelación y
descongelación definirá los índices de supervivencia de la célula congelada.
Los periodos críticos para la supervivencia celular durante la criopreservación son la
fase inicial del congelamiento y el período de retorno a condiciones fisiológicas. (AVILA_PORTILLO 2006)
La obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y o el tejido, puesto que este proceso está afectado por diferentes variables como especie, tipo y estado de la célula a congelar. Las células tienen diferente tamaño, manejan diferente composición de solutos y en general el éxito de la criopreservación esta inversamente correlacionado con la complejidad de los sistemas biológicos congelados.
La obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y o el tejido, puesto que este proceso está afectado por diferentes variables como especie, tipo y estado de la célula a congelar. Las células tienen diferente tamaño, manejan diferente composición de solutos y en general el éxito de la criopreservación esta inversamente correlacionado con la complejidad de los sistemas biológicos congelados.
La congelación de las
células vivas es un proceso fisico - quimico complejo de intercambio de agua
entre la célula y el medio que la rodea, existiendo un índice de enfriamiento
óptimo para cada tipo de células, lo cual depende del tamaño de la célula, la
relación entre su superficie y su volumen, su permeabilidad al agua y el
coeficiente de temperatura de esa permeabilidad. (PALASZ)
El objetivo principal de la criopreservacion es la interrupción del metabolismo por un tiempo determinado arbitrariamente, durante el cual las células se encuentran en una anabiosis artificial (estado de latencia). GORLACH 1998 dice que los momentos más críticos y sensibles de la criopresrevación son el momento de la congelación y descongelación. En esos instantes suceden una infinidad de procesos fisico-quimicos regidos por las diferencias de temperatura y transporte de agua entre las células y el medio. Sin embargo para mantener sus características originales (metabolismo y capacidad de crecimmiento) se obtiene únicamente con un crioprotector y de diferentes protocolos de congelación. (OCHOA 2011).
La bajas temperaturas (asociadas al aumento de la rigidez de la membrana) y la rapidez (décimas de segundo) con la que suceden los cambios osmóticos en los procesos de congelación y descongelación hacen muy difícil el movimiento de moléculas a través de la membrana mediante procesos de transporte activo (dependientes de ATP), la disminución de temperatura desde 25ºC a 10ºC reduce en un 60% la actividad de las bombas dependientes de ATP y la difusión facilitada como transporte y, en consecuencia, los procesos de difusión y ósmosis son los que predominan en los momentos de estrés osmótico.
La difusión es un proceso mediante el cual las moléculas de una sustancia tienden a alcanzar una distribución homogénea en todo el espacio que les es accesible. La magnitud de la tendencia a difundir desde una zona a otra si esta presente una membrana que separe las dos zonas esta definida por la ley de difusión de Fick, que relaciona el gradiente entre las dos zonas (gradiente químico o de concentración), las características de la membrana (grosor, área de sección transversa y permeabilidad para un determinado soluto), es directamente proporcional a la superficie (área) de la membrana y a la diferencia de concentración del soluto entre los dos lados e inversamente proporcional al espesor (grosor) de la membrana. La velocidad de la difusión es proporcional a una constante de difusión que depende de las propiedades de la membrana y decada soluto en particular, un equilibrio puede conseguirse en segundos si la distancia es de micras, pero puede subir a varias horas si la distancia de difusión se incrementa a 7 milímetros.
La ósmosis es un caso especial de difusión en el que es el movimiento del disolvente el que se estudia, y se define en función de los solutos. La ósmosis es el movimiento del agua desde soluciones con baja concentración de soluto hasta soluciones con alta concentración de soluto y la presión osmótica es la presión hidrostática que se genera a través de una membrana semipermeable con un gradiente de concentración a lado y lado, la cual depende del número de partículas de la solución.
La presión osmótica se suele expresar en osmoles y depende exclusivamente del número de partículas disueltas (moles) por unidad de volumen, con independencia de su carga eléctrica, peso o fórmula química. Puesto que los productos criopreservados se deben almacenar a temperaturas desde -133°C (vapores de nitrógeno líquido) a -196ºC (nitrógeno líquido), y a que a estas temperaturas no existen fenómenos de difusión ni energía térmica suficiente para llevar a cabo las reacciones químicas y por tanto las dificultades de la congelación no derivan de la permanencia a temperaturas bajas sino de los procesos de congelación y descongelación.
Las lesiones celulares crioinducidas se explica en función del hielo intracelular y el estrés osmótico al que se ven sometidas las membranas celulares durante la congelación.
AGENTES CRIOPROTECTORES ACP
Los crioprotectores son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que disminuyen el punto eutectico de una solución dada, en el cual tal composición solidifica como un elemento puro. El descenso del punto eutectico implica que se alcanzará una concentración de solutos a una temperatura menor, de forma que la célula estará más deshidratada y el gradiente osmótico al que estará sometido será menor. (AVILA PORTILLO 2006).
Los crioprotectores difieren en la velocidad para penetrar los tejidos, el grado de protección al cristal de agua que confieren y por la toxicidad química que pueden tener sobre las células. El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para cristalización dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que conforman las mezclas congelantes. (BELASCOAIN 2010).
Los crioprotectores se dividen en dos categorías, permeables o intracelulares y los no permeables o extracelulares.
Los permeables son de bajo peso molecular (BPM) como el Glicerol (G) Etilenglicol, (EG) Dimetilsulfoxido (DMSO) 1-2 Propanodiol (PROH), Propilenglicol (PEG), Etanol y otros alcoholes. Estos crioprotectores al penetrar la célula, reemplazan el agua intracelular minimizando la formación de cristales, regulan la deshidratación y protegen la estructura proteica del citoplasma.
Los crioprotectores con bajo peso molecular (BPM), al tener una mayor permeabiliad, permiten la reducción de los tiempos de exposición y la concentración, con lo cual se previene el daño osmótico causado en la células. Entre los crioprotectores de BPM, el más utilizado es el Etilenglicol (EG) ya que tiene una mayor velocidad de penetración y, por consiguiente, necesita menos tiempo de exposición, disminuyendo su efecto tóxico.
Los crioprotectores no permeables son a su vez:
- Azucares de BPM como la Sucrosa, Sacarosa, Glucosa, los cuales deshidratan las células antes de la congelación minimizando la formación de cristales a su vez que estabilizan la estructura de la membrana.
- Macromoléculas de Alto Peso Molecular (APM) como el Polivinilpirrolidona (PVP) Polivinilalcohol (PVA) Seroalbúmina Bovina (SAB), Ficol. Estos contribuyen a la reducción del crioprotector dentro de las células (KASAY Y MUKAIDA 2004) y protegen en la congelación/descongelación alterando el tamaño y la forma de los cristales (DE LA FUENTE 2009)
De igual forma, la asociación de uno o más crioprotectores con características más estables, permitirá la utilización de soluciones más simples y la reduccioón de su toxicidad específica. De acuerdo con algunos investigadores, la permeabilidad de la combinación de crioprotectores es mayor que la de sus componentes de forma individual (VAJTA Y NAGANY 2006).
Para reducir el daño osmótico y tóxico del crioprotector, debido a la alta concentración de sales, se está dejando de utilizar G y DMSO para hacer uso de EG, solo o en combinación con sacarosa o trealosa que han demostrado ser menos tóxico. El DMSO es muy tóxico a temperatura ambiente, lo que lo hace muy riesgoso y no se recomienda usarlo (BELASCOAIN 2010)
Las membranas celulares son las estructuras que sufren mayor daño en los procesos de congelación en general debido a la pérdida de fluidez de sus componentes lipídicos, la transición de lípidos fluidos a sólidos se da a una temperatura de 10°C - 16°C alterando de esta manera las funciones de la membrana y dándole un alto grado de fragilidad, durante la deshidratación celular que tiene lugar en el proceso de congelación se puede presentar una pérdida de lípidos lo cual afectaría la integridad de la membrana plasmática por pérdida de su capacidad de expansión durante la rehidratación al volver a condiciones isotónicas. (SEIDEL 2006)
Las crioinjurias de diversos tipos son difíciles de de considerar por separado ya que en la mayoría de los casos operan en conjunto.
Cada tipo celular debe ser congelado conociendo el perfil biofísico de la célula, el cual contará mediante ensayos de permeabilidad y volumen osmóticamente inactivo con diferentes crioprotectores o soluciones crioprotectoras a base de mezcla de crioprotectores
penetrantes y no penetrantes, el mejor protocolo de criopreservación de esa célula. Es importante asegurar un sistema de seguridad, de continuidad del nitrógeno líquido y ensayos de control de calidad por medio de pruebas de viabilidad. (AVILA-PORTILLO).
Por lo expuesto anteriormente se han desarrollado y constituido diferentes Escuelas o Técnicas De Criopreservación de Células Reproductivas y Embriones, por los distintos Centros De Reproducción Asistida, tanto desde el punto de vista investigativo como comercial, con resultados variables. La tendencia es la de unificar los diferentes protocolos resultantes, haciéndolos más prácticos, sencillos de ejecutar con porcentajes de fertilidad y fecundación cada día más altos y rentables, para su aplicación masiva en Producción Animal.
El objetivo principal de la criopreservacion es la interrupción del metabolismo por un tiempo determinado arbitrariamente, durante el cual las células se encuentran en una anabiosis artificial (estado de latencia). GORLACH 1998 dice que los momentos más críticos y sensibles de la criopresrevación son el momento de la congelación y descongelación. En esos instantes suceden una infinidad de procesos fisico-quimicos regidos por las diferencias de temperatura y transporte de agua entre las células y el medio. Sin embargo para mantener sus características originales (metabolismo y capacidad de crecimmiento) se obtiene únicamente con un crioprotector y de diferentes protocolos de congelación. (OCHOA 2011).
La bajas temperaturas (asociadas al aumento de la rigidez de la membrana) y la rapidez (décimas de segundo) con la que suceden los cambios osmóticos en los procesos de congelación y descongelación hacen muy difícil el movimiento de moléculas a través de la membrana mediante procesos de transporte activo (dependientes de ATP), la disminución de temperatura desde 25ºC a 10ºC reduce en un 60% la actividad de las bombas dependientes de ATP y la difusión facilitada como transporte y, en consecuencia, los procesos de difusión y ósmosis son los que predominan en los momentos de estrés osmótico.
La difusión es un proceso mediante el cual las moléculas de una sustancia tienden a alcanzar una distribución homogénea en todo el espacio que les es accesible. La magnitud de la tendencia a difundir desde una zona a otra si esta presente una membrana que separe las dos zonas esta definida por la ley de difusión de Fick, que relaciona el gradiente entre las dos zonas (gradiente químico o de concentración), las características de la membrana (grosor, área de sección transversa y permeabilidad para un determinado soluto), es directamente proporcional a la superficie (área) de la membrana y a la diferencia de concentración del soluto entre los dos lados e inversamente proporcional al espesor (grosor) de la membrana. La velocidad de la difusión es proporcional a una constante de difusión que depende de las propiedades de la membrana y decada soluto en particular, un equilibrio puede conseguirse en segundos si la distancia es de micras, pero puede subir a varias horas si la distancia de difusión se incrementa a 7 milímetros.
La ósmosis es un caso especial de difusión en el que es el movimiento del disolvente el que se estudia, y se define en función de los solutos. La ósmosis es el movimiento del agua desde soluciones con baja concentración de soluto hasta soluciones con alta concentración de soluto y la presión osmótica es la presión hidrostática que se genera a través de una membrana semipermeable con un gradiente de concentración a lado y lado, la cual depende del número de partículas de la solución.
La presión osmótica se suele expresar en osmoles y depende exclusivamente del número de partículas disueltas (moles) por unidad de volumen, con independencia de su carga eléctrica, peso o fórmula química. Puesto que los productos criopreservados se deben almacenar a temperaturas desde -133°C (vapores de nitrógeno líquido) a -196ºC (nitrógeno líquido), y a que a estas temperaturas no existen fenómenos de difusión ni energía térmica suficiente para llevar a cabo las reacciones químicas y por tanto las dificultades de la congelación no derivan de la permanencia a temperaturas bajas sino de los procesos de congelación y descongelación.
Las lesiones celulares crioinducidas se explica en función del hielo intracelular y el estrés osmótico al que se ven sometidas las membranas celulares durante la congelación.
AGENTES CRIOPROTECTORES ACP
Los crioprotectores son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que disminuyen el punto eutectico de una solución dada, en el cual tal composición solidifica como un elemento puro. El descenso del punto eutectico implica que se alcanzará una concentración de solutos a una temperatura menor, de forma que la célula estará más deshidratada y el gradiente osmótico al que estará sometido será menor. (AVILA PORTILLO 2006).
Los crioprotectores difieren en la velocidad para penetrar los tejidos, el grado de protección al cristal de agua que confieren y por la toxicidad química que pueden tener sobre las células. El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para cristalización dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que conforman las mezclas congelantes. (BELASCOAIN 2010).
Los crioprotectores se dividen en dos categorías, permeables o intracelulares y los no permeables o extracelulares.
Los permeables son de bajo peso molecular (BPM) como el Glicerol (G) Etilenglicol, (EG) Dimetilsulfoxido (DMSO) 1-2 Propanodiol (PROH), Propilenglicol (PEG), Etanol y otros alcoholes. Estos crioprotectores al penetrar la célula, reemplazan el agua intracelular minimizando la formación de cristales, regulan la deshidratación y protegen la estructura proteica del citoplasma.
Los crioprotectores con bajo peso molecular (BPM), al tener una mayor permeabiliad, permiten la reducción de los tiempos de exposición y la concentración, con lo cual se previene el daño osmótico causado en la células. Entre los crioprotectores de BPM, el más utilizado es el Etilenglicol (EG) ya que tiene una mayor velocidad de penetración y, por consiguiente, necesita menos tiempo de exposición, disminuyendo su efecto tóxico.
Los
crioprotectores como el Glicerol y Dimetilsulfóxido deben ser retirados de los
embriones antes de ser transferidos, ya que una vez en contacto con los fluidos
uterinos isotónicos, se produce una sobrehidratación que provoca daños
celulares irreversibles, con la subsiguiente muerte embrionaria debido al shock osmótico
consecuencia del rápido pasaje de agua hacia el interior de las células. Este shock osmótico puede ser
sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de
permeabilidad como el Etilenglico (CABRERA 2006)
Los crioprotectores no permeables son a su vez:
- Azucares de BPM como la Sucrosa, Sacarosa, Glucosa, los cuales deshidratan las células antes de la congelación minimizando la formación de cristales a su vez que estabilizan la estructura de la membrana.
- Macromoléculas de Alto Peso Molecular (APM) como el Polivinilpirrolidona (PVP) Polivinilalcohol (PVA) Seroalbúmina Bovina (SAB), Ficol. Estos contribuyen a la reducción del crioprotector dentro de las células (KASAY Y MUKAIDA 2004) y protegen en la congelación/descongelación alterando el tamaño y la forma de los cristales (DE LA FUENTE 2009)
De igual forma, la asociación de uno o más crioprotectores con características más estables, permitirá la utilización de soluciones más simples y la reduccioón de su toxicidad específica. De acuerdo con algunos investigadores, la permeabilidad de la combinación de crioprotectores es mayor que la de sus componentes de forma individual (VAJTA Y NAGANY 2006).
Para reducir el daño osmótico y tóxico del crioprotector, debido a la alta concentración de sales, se está dejando de utilizar G y DMSO para hacer uso de EG, solo o en combinación con sacarosa o trealosa que han demostrado ser menos tóxico. El DMSO es muy tóxico a temperatura ambiente, lo que lo hace muy riesgoso y no se recomienda usarlo (BELASCOAIN 2010)
Las membranas celulares son las estructuras que sufren mayor daño en los procesos de congelación en general debido a la pérdida de fluidez de sus componentes lipídicos, la transición de lípidos fluidos a sólidos se da a una temperatura de 10°C - 16°C alterando de esta manera las funciones de la membrana y dándole un alto grado de fragilidad, durante la deshidratación celular que tiene lugar en el proceso de congelación se puede presentar una pérdida de lípidos lo cual afectaría la integridad de la membrana plasmática por pérdida de su capacidad de expansión durante la rehidratación al volver a condiciones isotónicas. (SEIDEL 2006)
Hay que tener en cuenta que ningún protocolo de congelación o vitrificación disponible garantiza la integridad total de las estructuras de las células u organismos a criopreservar. Durante el proceso estas estructuras están expuestas a diversos tipos de injurias, las cuales son difíciles de considerar por separado ya que en muchos casos operan en conjunto.
Las crioinjurias podrían deberse a:
Formación de hielo intra o extracelular. Durante el proceso de criopreservación la formación de hielo intracelular puede deberse a tasas de descenso térmico muy altas. Por ello el agua endocelular no tiene tiempo suficiente para alcanzar el medio extracelular, se sobrenfría y alcanza la temperatura de nucleación para finalmente cristalizarse dentro del citoplasma. Por otra parte, si la tasa de ascenso térmico durante la descongelación o calentamiento no es lo suficientemente rápida, es posible que se produzca hielo intracelular como consecuencia de un nuevo pasaje a través de la temperatura de nucleación, o por crecimiento de los pequeños cristales que pudieran haberse generado durante el enfriamiento. Esto puede producirse además, por un desequilibrio entre la concentración del crioprotector y la tasa de descenso térmico. (KASAI)
Acker y McGann concluyeron que la propagación de cristales de hielo entre células adyacentes se establece mediante un proceso denominado "nucleación catalizada por superficie". Esto contrasta con la teoría de Berger y Uhrik e Inmia y Karisson, quienes sostienen que el hielo intracelular se propaga a través de uniones intercelulares tipo Gap. Sin embargo, otros autores sostienen que durante la criopreservación se generarían fuerzas suficientes como para producir pequeñas lesiones en la membrana plasmática por donde se propagaría el hielo. (MULDREW)
Aumento o disminución excesiva del volumen celular por efecto osmótico. La adición o extracción de las sustancias criopreservantes, así como el propio proceso de congelación (efecto de solución), producen cambios de volumen en las células embrionarias que, dependiendo de la magnitud, pueden afectar su supervivencia postcriopreservación. La disminución del volumen celular por una pérdida importante de agua puede determinar modificaciones en la composición del medio intracitoplasmático. Por otro lado, la deshidratación favorecería la pérdida de ubicación normal de las estructuras citoplasmáticas, aproximándose lo suficiente como para permitir reacciones intermoleculares.
La alta concentración de crioprotectores intracelulares puede determinar que las células embrionarias incorporen agua y aumenten excesivamente de volumen, pudiendo dañar estructuras internas o bien desintegrarse por completo.
Efecto tóxico del crioprotector. El citoesqueleto constituye una compleja red de filamentos proteicos, extendidos a través del citoplasma, que coordinan la organización y el movimiento intracitoplásmico . Sin embargo, los elementos que lo constituyen presentan un comportamiento inestable, en donde las subunidades que lo componen se encuentran en constante recambio. Aunque los crioprotectores son necesarios para minimizar los daños que puedan ocurrir durante la criopreservación, estos compuestos pueden también tener efectos nocivos sobre los embriones por toxicidad química. (DOBRINSKY)
Otras alteraciones asociadas con la adición de sustancias crioprotectoras son el aumento del espacio perivitelino, el aumento de tamaño mitocondrial y la presencia de vacuolas dentro de las mismas, así como la aparición de signos de degeneración nuclear. Además, el glicerol podría inhibir el sistema Na+ K+ ATPasa, el cual es fundamental para el mantenimiento del gradiente osmótico celular.
Alteraciones de las membranas celulares. Las membranas celulares (plasmática y de organelas) son negativamente afectadas por efecto osmótico durante los procesos de criopreservación y su lesión constituye uno de los indicadores más importantes de muerte celular. Cuando el contenido de agua intracelular disminuye por debajo de 10-20%, los componentes celulares permanecen muy juntos entre sí, pudiendo determinar que las membranas pasen de un estado gel de tipo laminar, a uno hexagonal de Fase II, aunque este proceso también puede producirse por efecto directo del frío. En este estado, formado por pequeños cilindros de agua rodeados por fosfolípidos, las membranas celulares pierden la capacidad para llevar a cabo la mayoría de sus funciones. Otra causa por la cual las membranas pueden lesionarse la constituye la formación de hielo intracelular (ACKER 1998)
Fractura embrionaria o de la Zona Pelúcida. Este tipo de lesiones, probablemente se produzcan debido a diferencias en la expansión de los cristales de hielo (39), lo cual generaría cambios irregulares de volumen en los medios de criopreservación durante un rápido cambio de fase. Según Kasai y col. durante la congelación convencional más del 50% de los embriones pueden ser físicamente dañados si las tasas de descenso-ascenso térmico durante la congelación-descongelación no son adecuadamente ajustadas. Esta lesión es más frecuente durante el calentamiento, y se produciría por el rápido pasaje a través de la temperatura en la cual se forma la fase vítrea (-110 a -135°C). (OCHOA)
Otras crioinjurias. Si bien durante la congelación, los embriones rara vez toman contacto directo con los cristales de hielo, permanecen en la fracción no congelada, donde son expuestos a diversos tipos de estrés físico, tales como:
- Daño mecánico como consecuencia de la formación de burbujas debido a un aumento de gas soluble.
- Alteración en los procesos de difusión y osmosis, producto de un aumento
de la viscosidad.
- Desnaturalización proteica, debido a cambios de pH. (MUCCI 2005)
En la Tabla 1 se señala el impacto de las diferentes crioinjurias sobre las estructuras preservadas en función del sistema de criopreservación utilizado.
Las crioinjurias de diversos tipos son difíciles de de considerar por separado ya que en la mayoría de los casos operan en conjunto.
Cada tipo celular debe ser congelado conociendo el perfil biofísico de la célula, el cual contará mediante ensayos de permeabilidad y volumen osmóticamente inactivo con diferentes crioprotectores o soluciones crioprotectoras a base de mezcla de crioprotectores
penetrantes y no penetrantes, el mejor protocolo de criopreservación de esa célula. Es importante asegurar un sistema de seguridad, de continuidad del nitrógeno líquido y ensayos de control de calidad por medio de pruebas de viabilidad. (AVILA-PORTILLO).
Por lo expuesto anteriormente se han desarrollado y constituido diferentes Escuelas o Técnicas De Criopreservación de Células Reproductivas y Embriones, por los distintos Centros De Reproducción Asistida, tanto desde el punto de vista investigativo como comercial, con resultados variables. La tendencia es la de unificar los diferentes protocolos resultantes, haciéndolos más prácticos, sencillos de ejecutar con porcentajes de fertilidad y fecundación cada día más altos y rentables, para su aplicación masiva en Producción Animal.
CRIOPRESERVACION DEL SEMEN
La
criopreservación del semen ha sido la
técnica más antigua y que más ha
influido en la difusión del empleo de la IA en la Reprodución Asistida. Como
regla general la refrigeración del espermatozoide es un método sencillo que de manera exitosa
ha permitido ampliar el tiempo de viabilidad del espermatozoide, al reducir su
tasa metabólica y por lo tanto prolongar la supervivencia del semen mediante la
disminución del porcentaje de sustratos empleados y la producción de toxinas.
Si bien la criopreservación garantiza la supervivencia de los espermatozoides, una elevada y variable proporción del proceso de congelación-descongelación afecta la integridad de la membrana plasmática (MP) y acrosomal (MA) tanto en lo referente a la morfología como a la funcionalidad, lo cual suele ocasionar daños irreversibles y causar muerte celular e infertilidad. Se ha demostrado como los espermatozoides de diferentes toros evaluados, resisten de manera distinta los efectos lesivos de la criopreservación, de manera indiscriminada sobre la integridad estructural y funcional MP y MA, lo que afecta la capacidad fecundante de las muestras seminales destinadas a IA. (RUBIO-GUILLEN 2009)
Por lo tanto el éxito de la criopreservación del semen depende de varios factores que interactúan entre sí como el criprotector, tipo de diluyente, tasa de enfriamiento, tasa de descongelación y empaque, así como la variación individual del reproductor.
Es inevitable que se presente perdida de la viabilidad del espermatozoide debido a su manejo antes del proceso de congelación así como durante el proceso mismo, por lo que el éxito de la criopreservación se mide por la capacidad de mantener su capacidad fecundante después de la descongelación. Para lograr lo anterior debe mantener su capacidad para producir energía mediante el metabolismo, mantener la configuración e integridad de la membrana plasmática, retener su motilidad y conservar las enzimas, como la acrosina, dentro del acrosoma para permitir la penetración del ovocito.
El semen después de refrigerado a 5-8°C
sobrevive por 24-48 horas y aún 96 horas sin que haya disminución del porcentaje de
fertilidad. En la actualidad la técnica congelación se ha estandarizado y el
semen se almacena indefinidamente en nitrógeno líquido a -198°C, manteniendo
una fecundación aceptable en las tasas de fertilización luego de la
descongelación. Generalmente, la viabilidad del esperma disminuye un 50% por
efecto de la criopreservación al afectar varios de los organelos espermáticos,
la inducción prematura de la reacción acrosómica, alteración de la función
mitocondrial, reducción de la motilidad y fallas en la decondensación de la
cromatina. (CHAVERIO 2006)
Otro
frente de investigación en la última década ha sido el de desarrollar métodos
que permiten examinar las características ultraestructurales del esperma y sus
alteraciones, entre las que se encuentra la prueba de kinética del esperma para
análisis de la motilidad mediante asistencia computarizada (Computer Assisted Semen
Analysis (CASA), prueba de resistencia osmótica (hypo-osmotic swelling test
HOST), evaluación de la integridad y permeabilidad de la membrana plasmática
mediante colorantes fluorescentes, evaluación del estado acrosomal con lectinas
fluoresceína isocianato conjugado, investigación de la integridad del ADN
utilizando SCSA (Chromatin Structure Assay Test SCSA) o evaluación del estado
de la arquitectura membranosa.
El empleo
de una combinación de pruebas en lugar de una sola prueba, puede conllevar a
obtener una información más completa sobre el estado del espermatozoide. Las
pruebas dirigidas a evaluar la integridad de la estructura cromática del
esperma son capaces de identificar los defectos espermáticos que normalmente no
se detectan durante los análisis convencionales del semen. Los métodos requieren de la aplicación de microscopio fluorescente y/o técnicas de citometría de flujo, por lo que por su alta cantidad, repetitibilidad y sensibilidad ya se desarrollan en muchas centrales modernas de Reproducción Asistida.
(LEMMA 2011)
MANEJO DEL SEMEN A CRIOPRESERVAR
Después de determinar la fertilidad del Reproductor, puede tomarse la decisión de recolectar muestras de semen para la producción de pajillas con destino al programa de inseminación. Ver el Capítulo Manejo Reproductivo Del Hato, Evaluación Calidad Seminal de esta publicación.
Con posterioridad a la evaluación de la calidad del semen y realizar el cálculo de la concentración espermática, es importante determinar la cantidad de Espermatozoides con Motilidad progresiva Morfológicamente Normales (MPMN) en el eyaculado. El número de MPNM será utilizado para calcular el número de dosis que pueden ser congeladas.
En el ejemplo siguiente se muestra la forma a seguir para calcular el número de dosis y dilución de una muestra de eyaculado. La existencia de numerosas fuentes de variación de la fertilidad (toro, eyaculado, número de espermatozoides, hembra, etc.) impone que el centro de inseminación artificial deba incluir en la dosis de semen congelado un número de espermatozoides bastante elevado. Cuando se utilizan 20 millones de espermatozoides/dosis, un porcentaje de de motilidad progresiva de 30 a 50% a la hora de cero postdescongelación, permite disponer de entre 6 a 10 millones de células espermáticas con motilidad progresiva/dosis. El profesional puede solicitar o considerar cual es la concentración deseada por pajilla. (CABODEVILLA)
La CSS tiene aprobados dos protocolos para la dilución del semen bovino, que son:
- El protocolo Estandar CSS que es un método de dos pasos.
- El protocolo Alternativo CSS que es un método de un paso
Requieren de yema de huevo para proteger las células espermáticas contra el shock térmico por frío y vienen presentados comercialmente con dos fracciones (A y B) y una mezcla de antibióticos. La Fracción B es similar a la Fracciónn A, excepto que contiene 14% de glicerol como crioprotector.
El protocolo de dos pasos logra una concentración final de 20% de yema de huevo, 7% de glicerol, 50 μg de Tilosina, 250 μg de Gentamicina, 150 μg de Lincomicina y 300 μg de estreptomicina por cada ml de semen diluido y congelado. Ejemplos de diluyentes comerciales disponibles en el mercado para el sistema de dos pasos son el Biladyl ®
Técnica de dilución del semen.
- Los antibióticos se adicionan cuidadosamente al semen puro en una proporción de 0.02 ml de la mezcla de por cada ml de semen. Los antibióticos deben estar en contacto por 3 a 5 minutos con el semen puro, antes de proseguir la dilución
- En un matraz o tubo de ensayo de 50 ml. se diluye el semen con antibióticos, con un pequeño volumen de Fracción A precalentada. Dependiendo del número calculado de pajillas a procesar, el eyaculado debe luego diluirse con más Fracción A hasta completar el 50% del volumen de diluyente total a usar. La Fracción A del diluyente debe tener la misma temperatura del semen al momento de mezclarse (20-32°C)
- Enfriar el semen diluido lentamente durante un período mínimo de dos horas hasta llegar a 4°C. Para realizar este paso, el recipiente con el semen diluido debe dejarse enfriar hasta temperatura ambiente y luego se coloca en un refrigerador a 4°C.
- Nota: 300 ml de líquido con temperatura de 30° a 35°C disminuyen su temperatura hasta 4°C en un período aproximado de 2 horas.
La segunda mitad del volumen total de diluyente corresponde a la Fracción B que contiene glicerol, la cual debe estar pre-enfriada a 4°C. El volumen de Fracción B se adiciona gradualmente al semen ya extendido con Fracción A durante un período de 30 minutos hasta alcanzar una proporción 1:1. El volumen final de semen completamente extendido contendrá una concentración final de 7% de Glicerol.
El semen completamente diluido debe tener un período de equilibrio a 4°C por un mínimo de 4 horas. Este tiempo puede ser usado para llenar y sellar las pajillas y ubicarlas sobre las gradillas de congelación y conteo e iniciar la curva de frío lenta.
El Protocolo Alternativo es un método de un paso. Es el método más empleado en Europa. Está aprobado para ser utilizado con Tris (hididroximetilamiometano) como amortiguador y requiere la adición de 20% de yema de huevo. El diluyente no está fraccionado y contiene 7% de Glicerol más antibióticos. El protocolo produce una concentración de 100 μg de Tilosina, 500 μg de Gentamicina 300 μg de Lincomicina y 600 μg de Estreptomicina por cada ml de semen diluido y congelado. Un ejemplo de diluyente comercial para este protocolo es el Triladyl
Técnica de dilución del semen.
- Igualar la temperatura del diluyente con la temperatura del semen, ubicando ambos componentes dentro de un baño maría a una temperatura de 28 a 32°C, Los antibióticos deben mantenerse a la misma temperatura.
- Los antibióticos son adicionados cuidadosamente al semen puro en una proporción de 0.02 ml de la mezcla por cada ml de semen. Los antibióticos deben estar en contacto por 3 a 5 minutos con el semen puro, antes de proseguir con la dilución.
- En un matraz o tubo de ensayo de 50 ml, se diluye inicialmente el semen con los antibióticos, con un pequeño volumen de diluyente, en forma lenta.
- Dependiendo del número de pajillas a procesar, prosiga la dilución del semen hasta alcanzar el volumen total de dilución.
- Enfriar lentamente el semen diluido durante un período mínimo de 2 horas hasta llegar a 4°C y continúe el proceso como en el protocolo estandar (BARACALDO)
Durante la preparación de los diluyentes se puede utilizar un agitador magnético para asegurar su dilución y mezcla. Después del proceso de mezclado se puede o no filtrar el diluyente.
Una vez realizada la dilución se continúa con el marcado, llenado y sellado de las pajillas. Este proceso puede efectuarse a temperatura ambiente o después de entrar la dilución del semen a 4°C, de manera manual o computarizada. Actualmente se utilizan pajillas de 0.25 y 0.5 ml.
Después del llenado, las pajillas se sellan manualmente con polvo de polivinilo, selladores térmicos o por ultrasonido, esferas metálicas o de vidrio, dependiendo del equipo empleado.
El proceso de congelación en Centrales de Reproducción se efectúa en equipos computarizados. Con este sistema existe la opción de congelar un número mínimo, hasta miles de pajillas en un solo paso, en forma confiable y exacta. Las congelaciones computarizadas ofrecen posibilidades ilimitadas para almacenar diferentes programas de congelación, utilizando tasas de congelación desde 0.01 hasta 60°C/minuto, con una exactitud máxima y en rangos de temperatura desde +40°C a -180°C.
Después del proceso de congelación se trasfieren las pajillas a termos de almacenamiento con nitrógeno líquido, usados para distribución y comercialización del semen congelado.
Es importante evaluar los lotes de pajillas luego de su descongelación, para darles el visto bueno y calificarlas como aptas para inseminación o rechazarlas.
Esta evaluación se lleva a cabo después de descongelarlas a 35°C en 30 segundos, hora 0 y 2 horas después. Se debe así mismo enviar una pajilla para análisis microbiológico.
En la Tabla 3 se especifican los parámetros dentro de los cuales se considera que una pajilla de semen congelado-descongelado tiene una fertilidad aceptable.
La Tabla 4 muestra los parámetros que debe llenar una pajilla de semen congelado-descongelado para que sea considerada como fértil.
Gráfico 1
Estudio realizado por CABODEVILA que muestra las principales causas de descarte de lotes de pajillas congeladas-descongeladas que no alcanzan los valores recomendados de dos o más pasos
CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES
La producción de embriones ha crecido de manera sistemática y exponencial, debido a la fertilización in vitro (FIV), simplificación de los protocolos, de criopreservación, utilización de nuevas mézclas de crioprotectores, así como su aplicación en la producción en diferentes especies domésticas, tanto desde un contexto científico como comercial.
La criopreservación de embriones es una técnica que se aplica cuando hay disponibilidad de embriones de excelente calidad que no son trasferidos en fresco y pueden aprovecharse posteriormente. Su objetivo es el de reducir los procesos metabólicos del embrión a su mínima expresión y que se puedan conservar el mayor tiempo posible, garantizando que en el momento de su utilización, luego de la descongelación, mantengan su viabilidad y por lo tanto lleguen a terminar en una gestación.
Básicamente, la criopreservación embrionaria contempla cuatro etapas:
a) Suspensión de los embriones en soluciones a la que se les han adicionado crioprotectores.
b) Enfriamiento en condiciones tales que eviten la formación de cristales intracelulares
cuando se sumergen en nitrógeno liquido (-196 ºC).
c) Entibiamiento de los embriones a temperaturas fisiológicas para reasumir las funciones
d) Remoción de los crioprotectores (dependiendo del crioprotector empleado. (BELASCOAIN 2010)
La criopreservación de embriones tiene ventajas tanto desde el punto de vista biológico como comercial, al facilitar su almacenamiento, transporte y utilización en periodos posteriores a voluntad de los propietarios, ya sea en programas Sincronización de Receptoras y Transferencia De Embriones a Tiempo Fijo, como en programas de trasplante de embriones en receptoras a celo detectado.
Este último programa está siendo implementado por el Laboratorio de Reproducción Animal de Corpoica Tibaitata, bajo la dirección del Dr Aldemar Chavez R. MVZ. 2015, el cual incluye la producción masiva de embriones FIV y el reentrenamiento de los Inseminadores a nivel de finca en las distintas Asociaciones o Comités de Ganaderos a nivel nacional (Informe personal)
La
viabilidad de los embriones congelados producidos in vitro, en comparación con los in
vivo, es menor probablemente debido a las características físicas propias
de este tipo de embriones, que hace que sean más sensibles al momento de ser
expuestos a bajas temperaturas.
Numerosos
equipos de investigación han demostrado que el embrión FIV es mucho más
sensible a la congelación que el producido in vivo. Así, las tasas de
gestación tras la transferencia a hembras receptoras de embriones in vivo
congelados se acercan a las obtenidas con embriones frescos (60%), mientras
que para el caso de los producidos in vitro no se supera el
20-30% de gestaciones. El camino a seguir en el terreno de la criobiología
consiste en determinar el origen de las lesiones que se producen en el embrión
FIV, así como poner a punto diferentes sistemas que, proporcionen una
protección al embrión y permitan obtener una tasa de desarrollo normal tras
su congelación/descongelación.
Entre dichas características, se encuentran diferencias no solo morfológicas sino también fisiológicas, como:
1.- El aumento en el número de vacuolas.
2.- Mayor fragilidad de la zona pelúcida.
3.- Menor compactación embrionaria.
4.- Un menor número de blastómeras, sobre todo en la masa celular interna.
5.- Alteraciones en la expresión génica.
6.- Mayor tasa de apoptosis.
7.- Aumento en el alto contenido citoplasmático de lípidos (RODRIGUEZ 2011)
Gran parte de los investigadores centran actualmente sus estudios en este campo, con el fin de encontrar el origen de esta mayor sensibilidad a las bajas temperaturas de los embriones FIV y poder mejorar los resultados obtenidos hasta ahora
7.- Aumento en el alto contenido citoplasmático de lípidos (RODRIGUEZ 2011)
Gran parte de los investigadores centran actualmente sus estudios en este campo, con el fin de encontrar el origen de esta mayor sensibilidad a las bajas temperaturas de los embriones FIV y poder mejorar los resultados obtenidos hasta ahora
Los
primeros resultados obtenidos apuntan hacia la existencia de importantes
diferencias entre ambos tipos de embriones:
a)
Diferencias estructurales: los embriones FIV parecen tener menor densidad que
los obtenidos in vivo, posiblemente debido a su mayor contenido en
lípidos. No obstante, no se conoce el mecanismo exacto por el que este hecho
podría explicar una mayor sensibilidad al enfriamiento de los embriones FIV.
b) Diferencias
en el metabolismo: los embriones FIV podrían desarrollar diferentes rutas
metabólicas que explicarían también el diferente contenido en lípidos. Aunque
el contenido en lípidos parece afectar la sensibilidad al frío y alterar la
supervivencia embrionaria
durante la congelación, existen otros factores como la velocidad de enfriamiento,
la edad y el estado de desarrollo de los embriones, características celulares
(permeabilidad celular, propiedades osmóticas) y la utilización de diferentes
crioprotectores, que también tienen un efecto importante sobre la congelabilidad
de los embriones. (DÍEZ MONFORTE)
METODOS DE CRIOPRESERVACION
Los principales métodos utilizados para la criopreservación de embriones son, Congelación Convencional, Congelación Ultrarrápida y la Vitrificación, con sus respectivos protocolos y variantes. Todos tiene el mismo fin que es conservar la célula o el embrión el mayor tiempo con la mayor fertilidad, pero después del análisis de dichos métodos se puede concluir que a pesar de los cambios que se producen a nivel estructural y metabólico en el post congelado, el de congelación convencional es el más adecuado debido a que se garantiza una mayor eficiencia de los crioprotectores, gracias a la congelación lenta, lo que no sucede con la vitrificación por la violenta congelación del embrión al entrar en contacto con el nitrógeno líquido produciendo daños celulares. (OCHOA 2011)
La congelación de embriones puede ser realizada en diferentes estados de desarrollo, teniendo cada uno diferentes tasas de supervivencia, así como también ventajas y desventajas. La eficiencia de un programa de congelación se evalúa por la observación de la integridad morfológica del embrión en descongelación, la habilidad de clivar in vitro y su capacidad de implantación. (AVILA-PORTILLO 2006)
Los métodos de criopreservación podemos clasificarlos de acuerdo a la velocidad de congelación y descongelación, con protocolos diferentes:
La congelación de embriones puede ser realizada en diferentes estados de desarrollo, teniendo cada uno diferentes tasas de supervivencia, así como también ventajas y desventajas. La eficiencia de un programa de congelación se evalúa por la observación de la integridad morfológica del embrión en descongelación, la habilidad de clivar in vitro y su capacidad de implantación. (AVILA-PORTILLO 2006)
Los métodos de criopreservación podemos clasificarlos de acuerdo a la velocidad de congelación y descongelación, con protocolos diferentes:
- Congelación Lenta-descongelación lenta.
- Congelación Lenta-descongelación rápida en las cuales la adición del crioprotector suele hacerse por pasos y el descenso de la temperatura se realiza lentamente en un congelador programable. La descongelación rápida se hace en poco tiempo a temperatura ambiente o en un baño maría a 30°C para evitar la recristalización.
- Congelación Ultrarrápida, originalmente descrita para la congelación de embriones, por Trouson en 1986. Implica la rápida deshidratación celular, utilizando altas concentraciones de crioprotector, usualmente DMSO y sacarosa, seguida de inmersión en nitrógeno líquido.
- Vitrificación; se basa en la congelación rápida en una mezcla de altas concentraciones de crioprotectores, que a bajas temperaturas aumentan su viscosidad formando un sólido amorfo sin formación de hielo. No se requiere la utilización de un congelador programable (AVILA-PORTILLO)
El congelamiento convencional tiene una ventaja comparativa frente a los otros métodos de criopreservación, al ser una metodología que permite la utilización de bajas concentraciones de crioprotectores y permite la transferencia directa de los embriones después de la descongelación. Sin embargo, su habilidad para prevenir la formación de hielo intracelular aún es limitada, además, los resultados in vitro de la criopreservación de embriones han sido variables y menores en comparación a los datos obtenidos en embriones in vivo (DINNYES Y NEDAMBALE 2009).
Hay que tener en cuenta que ningún protocolo de congelación o vitrificación disponible garantiza la integridad total de las estructuras de las células u organismos a criopreservar.
CONGELACION LENTA O CONVENCIONAL
Esta técnica de CONGELACION LENTA, fue el primer método introducido en la conservación de embriones bovinos y hoy es el más utilizado comercialmente. Su curva de congelación lenta permiten mantener el equilibrio entre los factores que pueden causar daño celular, como la formación de cristales de hielo, fractura del embrión, daño tóxico y osmótico, alteración de organelas intracelulares y del citoesqueleto. (VAJTA Y KUWAYAMA 2006)
Esta técnica de CONGELACION LENTA, fue el primer método introducido en la conservación de embriones bovinos y hoy es el más utilizado comercialmente. Su curva de congelación lenta permiten mantener el equilibrio entre los factores que pueden causar daño celular, como la formación de cristales de hielo, fractura del embrión, daño tóxico y osmótico, alteración de organelas intracelulares y del citoesqueleto. (VAJTA Y KUWAYAMA 2006)
Básicamente,
la congelación/descongelación de embriones consiste en la realización de cuatro
etapas:
1.-
Suspensión de los embriones en una solución que contiene una sustancia
denominada "crioprotector", cuya finalidad es proteger a los
embriones de los efectos perjudiciales del frío.
2.-
Congelación propiamente dicha, y almacenamiento en Nitrógeno líquido.
3.-
Descongelación de los embriones.
4.-
Transferencia (directa o con retiro del crioprotector)
Normalmente, el medio que
contiene los embriones se enfría por debajo de su punto de congelación sin
formar cristales de hielo, fenómeno conocido como súper-enfriamiento. Luego, a
una temperatura más baja, ocurre la formación de núcleos de hielo, seguida por
un rápido incremento en la temperatura debido a la liberación del calor de
fusión latente.
En la actualidad se prefiere utilizar el Etilenglicol como crioprotector, ya que no necesita ser removido del embrión antes de la trasferencia como sucede con el Glicerol utilizado en un principio. El Etilenglicol a concentración de 1.5 M permite obtener tasas de preñez entre el 50 al 70% postcongelación.
Los embriones
seleccionados son colocados
en el medio de congelación a base de PBS suplementado con SFB al 10-20% y 1.0 a
1.5 M de Etilenglicol, a temperatura ambiente (20°C), dejándolos por 8 a 10
minutos para permitir que el crioprotector se equilibre dentro de las células
embrionarias.
Durante este período de equilibrio se empacan los
embriones en pajillas francesas de 0.25 a o.5 ml, las cuales se sellan en su extremo abierto con alcohol polivinilo.
Figura 1 (1-2)
Figura 1 (1-2)
A partir de 2009 más del
99% de los embriones de vacas de carne y leche en los Estados Unidos han sido
congelados en Etilen Glicol por la American Embryo Transfer Association (AETA)
para una Trasferencia Directa TD.
Una vez empacados los
embriones en las pajillas se colocan inmediatamente en la cámara del congelador
a una temperatura de -6 a -7°C, , dejándose por 5 minutos, en vapores de
nitrógeno, con lo cual se logra el equilibrio
Se han desarrollado protocolos estándares de descongelación, de uso ya común para cada uno de los diferentes métodos de criopreservación.
De esta manera se extraen las pajuelas con los embriones congelados del nitrógeno líquido, se mantienen 15 segundos en el aire y a continuación otros 15 segundos 30 ºC donde descongelan.
Después de esto se secan las pajillas, se quita el tapón rotulado y, según la técnica de congelación seguida, se someten a una manipulación previa (dilución de la glicerina) o, si son embriones conservados en etilenglicol, se transfieren directamente.
BELASCOAIN MG DIAZ ET HUTER S. TECNICAS PARA LA CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES BOVINOS. Universidad Nacional De Cordoba. Instituto De Reproducción Animal Cordoba (IRAC) 2010
BIELANSKI, A.; BERGERON, H.; LAU, P.C.; DEVENISH, J. 2003. Microbial contamination of embryos and semen during long term banking in liquid nitrogen. Cryobiology. 46(2):146-152.
BONILLA L. BLOCK J. HANSEN PJ. VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS EN PAJILLA ABIERTA. Procedures for In Vitro Production of Bovine Embryos‐ University Florida. Dept. of Animal Sciences, University of Florida and Ovatech LLC
CABRERA P. FERNANDEZ A. BASTIDAS P. MOLINA M. BETHENCOURT A. DIAZ T. VITRIFICACION: UNA ALTERNATIVA PARA LA CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES. Rev. Fac. Cienc. Vet. v.47 n.1 Maracay jun. 2006. versión impresa ISSN 0258-6576. Instituto de Reproducción Animal e Inseminación Artificial, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Central de Venezuela (FCV-UCV),
CALOMARDE C. VITRIFICACIÓN Y CONSERVACIÓN DE MÓRULAS DE CONEJO EN ETILENGLICOL A -80ºC Y A -196ºC. TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA. VALENCIA, JULIO 2014
CELESTINOS M. GATICA R. VITRIFICACIÓN COMO TÉCNICA DE CRIO CONSERVACION DE EMBRIONES BOVINOS. Vitrification as a technique of bovine embryo cryopreservation Versión Impresa ISSN 0301-732X Arch. med. vet. v.34 n.2 Valdivia 2002
Para evitar un
superenfriamiento extenso, se debe inducir la cristalización del hielo en
el medio extracelular más ó menos a 2°C por debajo de su punto de congelación
(-4 a -7°C), por medio de
la inducción de la formación de un cristal de hielo en el medio. Esto se conoce
en inglés como "SEEDING" o “SIEMBRA”.
La inducción de la cristalización del hielo en el medio
extracelular o “SEEDING” se lleva a cabo mediante la aplicación de una pinza
hemostática o un topito de algodón preenfriados en el nitrógeno líquido,
tocando la pared exterior de la pajilla, teniendo cuidado de no tocar la
columna del medio que contiene el embrión. Debe observarse una mancha blanca
por debajo del menisco donde se aplicó la pinza, lo que confirma que el proceso
de cristalización se ha efectuado correctamente.
Se recomienda que el proceso de cristalización se realice
individualmente y no en conjunto de la totalidad de los embriones a congelar.
La técnica correcta es empacar un embrión,
colocarlo en la criocámara e inmediatamente realizar la cristalización de la
pajilla en forma individual. Se deben
mantener las pajillas a esta temperatura por 10 minutos más para permitir que
la cristalización del medio alcance su equilibrio.
Luego se enfrían los embriones a una tasa de 0.3 a 0.8 °C/min hasta alcanzar una
temperatura de entre -30 y -40°C, colocando luego las pajillas en una cánula plástica
para después ser depositadas en un gobelet, para sumergirlas posteriormente en
nitrógeno líquido a -196°C dentro de un termo de congelación y su almacenamiento.(MAPLETOF)
Se han desarrollado protocolos estándares de descongelación, de uso ya común para cada uno de los diferentes métodos de criopreservación.
De esta manera se extraen las pajuelas con los embriones congelados del nitrógeno líquido, se mantienen 15 segundos en el aire y a continuación otros 15 segundos 30 ºC donde descongelan.
Después de esto se secan las pajillas, se quita el tapón rotulado y, según la técnica de congelación seguida, se someten a una manipulación previa (dilución de la glicerina) o, si son embriones conservados en etilenglicol, se transfieren directamente.
CONGELACION ULTRARRAPIDA
Según MUCCI N. et al 2005, los embriones son deshidratados parcialmente como ocurre en el método estándar y luego se les deshidrata nuevamente. Se utiliza una solución con 2 a 4,5 Molar de un crioprotector permeable (Glicerol, Propanediol, DMSO o Etilenglicol), y 0,25 a 0,5 Molar de otro no permeable (sacarosa, tetralosa, lactosa).
Esta segunda deshidratación deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rápidamente. Las pajillas son colocadas en el cuello del termo de nitrógeno, durante 5 minutos. Posteriormente son sumergidas al nitrógeno líquido (NL). Los resultados obtenidos fueron dispares, según el estado de desarrollo del embrión congelado.
Otros autores como Díaz, C, et al, 2004 destaca que. La desvitrificación requiere diluir y retirar el agente crioprotector antes de transferir el embrión. Las condiciones de manipulación (temperatura ambiental -39ºC, temperatura de las soluciones de desvitrificación -41ºC-, dilución en soluciones con concentraciones decrecientes de sacarosa) son difíciles de establecer en las granjas, extremo muy importante en el caso del ganado vacuno.
Según MUCCI N. et al 2005, los embriones son deshidratados parcialmente como ocurre en el método estándar y luego se les deshidrata nuevamente. Se utiliza una solución con 2 a 4,5 Molar de un crioprotector permeable (Glicerol, Propanediol, DMSO o Etilenglicol), y 0,25 a 0,5 Molar de otro no permeable (sacarosa, tetralosa, lactosa).
Esta segunda deshidratación deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rápidamente. Las pajillas son colocadas en el cuello del termo de nitrógeno, durante 5 minutos. Posteriormente son sumergidas al nitrógeno líquido (NL). Los resultados obtenidos fueron dispares, según el estado de desarrollo del embrión congelado.
Otros autores como Díaz, C, et al, 2004 destaca que. La desvitrificación requiere diluir y retirar el agente crioprotector antes de transferir el embrión. Las condiciones de manipulación (temperatura ambiental -39ºC, temperatura de las soluciones de desvitrificación -41ºC-, dilución en soluciones con concentraciones decrecientes de sacarosa) son difíciles de establecer en las granjas, extremo muy importante en el caso del ganado vacuno.
VITRIFICACION DE EMBRIONES
Además de la
criopreservación de los embriones PIV, por métodos convencionales, en los últimos años se ha desarrollado una nueva técnica denominada Vitrificación. La Vitrificación a diferencia de la congelación lenta, es la solidificación de una solución, mediante el aumento extremo de la viscocidad a bajas temperaturas sin que se formen cristales, proceso realizado por la deshidratación de las células luego de su exposición a altas concentraciones de Crioprotectores (4-8 mol/L), antes de iniciar el enfriamiento ultrarrápido, lo cual es necesario para lograr la vitrificación intra y extracelular.(VAJTA Y KUWAYAMA 2006).
En la Vitrificación, la curva de enfriamiento es más rápida (≈2500°C/ min) y necesita de la presencia de los crioprotectores que permiten la formación del "estado vítreo" y disminuyen los daños quimicos y mecánicos causados durante el paso entre los puntos críticos de congelación. (KASAI 2004)
En la Vitrificación, la curva de enfriamiento es más rápida (≈2500°C/ min) y necesita de la presencia de los crioprotectores que permiten la formación del "estado vítreo" y disminuyen los daños quimicos y mecánicos causados durante el paso entre los puntos críticos de congelación. (KASAI 2004)
El resultado de la vitrificación está condicionado previamente por dos
factores. La calidad del embrión y el estado de desarrollo embrionario. Cuando
se congelan embriones de calidades muy buena y buena se obtienen mejores
resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular. La etapa del
desarrollo más apropiada para la vitrificación de embriones es mórula compacta
a blastocisto expandido, siendo más sensibles a las bajas temperaturas los
embriones producidos in vitro. (CELESTINOS 2002)
La etapa de desarrollo del embrión más apropiada para la vitrificación en Etilen Glicol es la mórula compacta y blastocisto temprano tanto en los producidos in vivo como in vitro. Otro aspecto a considerar es la calidad de los embriones a vitrificar, ya que cuando se congelan embriones de buena calidad, se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular.
Para elegir el mejor método de vitrificación se den tomar en cuenta diferentes factores con: Crioprotectores a utilizar, estos deben manejarse en adecuada concentración, adicionarse al embrión en forma creciente y a tiempos determinados, en combinación con otros rioprotectores que sean de baja toxicidad, para que sean utilizados con el menor volumen posible. Temperatura de adición con tasas de enfriamiento lo suficientemente rápidas para evitar la pérdida del equilibrio osmótico y causar daño celular que comprometa la viabilidad embrionaria. (CELESTINOS).
Con respecto a la vitrificación, puede concluirse que los resultados de la viabilidad poscongelado varian según el protocolo y la metodología de la obtención de los embriones. Debido al desarrollo de la técnica de FIV y su cada vez mayor utilización en Programas de Fertilización Asistida, se han desarrollado y modificado en el tiempo muchos Protocolos y Técnicas cuya aplicabilidad depende del estado de desarrollo embrionario, los crioprotectores utilizados y en gran medida de la habilidad y destreza del personal especializado
La Solución de Equilibrio (SE) está compuesta por una Solución Básica (SB) con un pH estable que oscila entre 7.2 y 7.4, suplementada con bajas concentraciones de crioprotectores y diferentes tiempos de exposición, habiendose reportado valores de 1,5 minutos (VAJTA), 5 min (MARTINEZ 2002; VARAGO 2006; HUANG 2007), 7 minutos (DOBRINSKY) o 10 minutos (MARTINEZ 2006).
Las Soluciones de Equilibrio están compuestas por Soluciones Básicas mezcladas con los diferentes crioprotectores en menores proporciones que las Soluciones Vitrificantes
- G10% + PG 20% en PBS (SHEFFEN)
- DMSO 10% + EG 10% en WS (HAJARIAN 2011)
- EG 7.5% + DMSO 7.5% (BONILLA 2011)
- DMSO 5% (v/v) EG 5% (v/v) en DPBS (CALOMARDE 2014)
Inicialmente,
se utilizó para la vitrificación la pajilla plástica convencional de 0,25 ml la cual, utiliza volúmenes grandes de crioprotector (>20 μL) En este caso los embriones, luego del equilibrio, son aspirados al interior de la pajilla con soluciones crioprotectoras, separadas en dos compartimentos por burbujas de aire lográndose la vitrificación por inmersión directa en nitrógeno líquido. Con esta
técnica se obtuvo un 57% (20 de 35) de reexpansión in vitro en
embriones bovinos. (OCHOA 2011)
TECNICA PAJILLA ABIERTA ESTIRADA OPS
El tercio central de la pajilla es apoyado y calentado por 30 segundos sobre la esquina de una placa térmica a 90°C, hasta el evidente reblandecimiento del plástico. Una vez logrado esto, ambos extremos son traccionados en un plano horizontal hasta lograr en la porción central la reducción del diámetro del grosor de la pared.
Luego, se cortan las pajillas con un bisturí en la sección delgada, para ser esterilizadas utilizando luz ultravioleta y almacenadas hasta su utilización. El volumen de solución crioprotectora que contendrá el extremo delgado de la pajilla será de 2µl, correspondientes al volumen de la gota desde la cual el embrión será cargado por capilaridad (SILVA 2004)
En la actualidad se cuenta con OPS ® MINITUB, producidas comercialmente.
Este adelgazamiento
de la pajilla permite utilizar un menor volumen de crioprotector y la tasa de
enfriamiento pasa de 2500°C/min, obtenidos con las pajillas convencionales,
hasta los 20.000°C/min, obtenidos con la OPS. Con este sistema, el embrión es cargado en el medio de mantenimiento (volumen
0,5μL - 1μL), por la parte más fina de la pajilla, y por capilaridad asciende en una columna líquida de 2 a 3 cm y un volumen de 1 a 1.5 ml e inmediatamente, es
sumergido en nitrógeno líquido, quedando en contacto directo con él durante el periodo
de almacenamiento, o Sistema de Almacenamiento Abierto OPS (CELESTINOS & GATICA 2002).
Al evaluar esta técnica de vitrificación OPS en embriones bovinos producidos in vivo, se obtuvo una tasa de reexpansión del 84,6% (33 de 39) y una tasa de eclosión del 66,6% (26 de 39; , mientras que embriones bovinos producidos in vitro presentaron una tasa de reexpansión de 52% (27 de 52).(SAALFELD 2002)
Sin embargo, esta exposición directa con el nitrógeno y la posibilidad de contaminación con patógenos virales durante el almacenamiento obligaron a desarrollar nuevos Sistemas de Almacenamiento Cerrado CPS, eliminando el riesgo de contaminación. (BIELANSKI 2003)
A partir de allí, se desarrollaron otras técnicas con el fin de reducir el volumen del crioprotector utilizado en la vitrificación.
"CRYOTOP ® " (KITAZATO COM, Fuji Japan)
El Cryotop ® es un método de vitrificación de volumen mínimo. Está compuesto por una lámina especial de polipropileno delgado y estrecho (0.4 mm de ancho, 20 mm de largo, 0.1 de espesor) unida a soporte plástico duro. Con el fin de proteger el soporte del daño mecánico durante el empaque, se protege con una funda plástica larga de 3 cm; en esta funda se inserta la lámina de propileno.
El CRYOTOP® con un volumen de 0.1 μl enfría a un promedio de 69.25 ± 4,280°C/min de 20°C a - 120°C cuando se introduce directamente en nitrógeno líquido y se calienta desde los −170°C to −30°C a un promedio de 117,500 ± 10,630°C/min, cuando se transfiere abruptamente del nitrógeno líquido a una solución de 2 ml de Sucrosa a 23°C.
Con base en los resultados de altas tasas de supervivencia y desarrollo en la gran mayoría de las especies como Porcinos (USHIJIMA 2004), Bovinos (MORATO 2008), Murinos (LING 2009), Búfalos (LIANG 2012), Humanos (ROY 2014) y Conejos (MARCO-JIMENEZ 2016), el método CRYOTOP® ha sido considerado como la llave maestra de la vitrificación. (MARCO-JIMENEZ 2016)
Con el método de Cryotop se puede utilizar una gran variedad de medios de equilibrio, vitrificación, dilusión, de acuerdo a los requisitos específicos de cada especie o el estado de desarrollo del embrión, así como el criterio y experiencia del Profesional.
En general una proporción equimolar de EG y DMSO suministra una combinación efectiva, usando un método de equilibrio y vitrificación en varios pasos y una suplementación de sacarosa en la concentración final de desvitrificación. El EG es considerado como un componente estandar de las soluciones de vitrificación de mayor éxito. La combinación con DMSO se utilizó por primera vez por Ishimori y colaboradores, observandose un aumento de la permeabilidad del EG. (VAAMONDE 2010)
"CRYOLOOP" (CPIL, DELTALAB, Rubí, Spain)
El Cryoloop o CPIL está compuesto por un dispositivo de plástico suave flexible desechable (nylon), de 0.5 a 0.7 mm de diámetro, junto con una funda, de un vial de congelación. Este dispositivo es un asa utilizada en microbiología para recolectar y sembrar muestras de un cultivo de microorganismos. (SAKI 2005)
Actualmente son fabricados en polipropileno grado médico, esterilizado mediante gases de óxido de etileno.
Son libres de lubricantes, aceites o cargas electrostáticas. Esta dentro de una bolsa plástica individual. Además el asa está cubierta por una funda de plástico (pajilla de 3 cm de largo y 0.5 ml) en la punta de la lámina del Cryoloop, para protegerlo durante el almacenamiento en el termo de nitrógeno, de acuerdo con las regulaciones de la UE.(MARCO-JIMENEZ 2016).
Mientras los embriones son expuestos a las soluciones crioprotectoras, el «cryoloop» es sumergido en la solución crioprotectora, creando una película delgada en el asa de polipropileno. Luego, los embriones son capturados en dicha película y transferidos hasta el vial, el cual ha sido sumergido y llenado previamente con nitrógeno líquido. (LANE)
Además de los sistemas de empaque descritos se han desarrollado otros como
El plástico debido a sus características físicas, tiene una baja conductividad de calor, que limita las tasas de congelamiento, por lo tanto el uso de otros materiales con mayor conductividad como el vidrio, metal o el cuarzo, permiten aumentar el intercambio de calor y las tasas de enfriamiento, alcanzando velocidades de casi 30.000°C/min. Varios autores
demostraron esta eficiencia, al alcanzar mayores tasas de congelamiento con micropipetas de vidrio (GMP) en comparación con las OPS, y mayores tasas de supervivencia post-vitrificación, debido a una mayor conductividad y la utilización de un menor volumen de crioprotectores. (RODRIGUEZ 2011)
Al evaluar la viabilidad de los embriones utilizando sistemas abiertos (OPS) vs sistemas cerrados (SOPS), YU et al. 2010 no encontraron diferencias significativas en las tasas de viabilidad a las 72 horas post-vitrificación, 35,2% y 34,9%, respectivamente.
FASE DE CALENTAMIENTO - DESVITRIFICACION - DESCONGELACION
Para la denominación de este proceso en los protocolos de vitrificación, se han empleado los términos descongelación, desvitrificación y calentamiento. Cuando se habla de llevar nuevamente el material biológico vitrificado a la temperatura ambiente del laboratorio se utiliza el término calentar y no descongelar. Por otra parte, desvitrificación no significa, como parecería, salir del estado de vitrificación para regresar a la temperatura óptima celular o corporal, sino que indica pérdida del estado vítreo pasando al de cristalización, hecho indeseable que puede ser incompatible con la viabilidad celular y embrionaria (CABODEVILA 2001 SHAW 2003)
Estos procesos tienen como finalidad llevar el ovocito o embrión a su estado estructural antes de la vitrificación. Teniendo en cuenta lo anterior puede considerarse esta fase como una restitución de las células a su estado natural, por lo que se sugiere emplear este término para denominar este paso.
Antes de realizar la transferencia, los crioprotectores utilizados deben ser retirados en forma lenta de los embriones, ya que, una vez en contacto con los fluidos uterinos isotónicos, se produce una sobrehidratación que provoca daños celulares irreversibles con ruptura de la membrana celular y la posterior muerte embrionaria. Este shock osmótico puede ser sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de permeabilidad como el etilenglicol. (CABRERA et al. 2006).
Una vez calentadas las pajuelas, los crioprotectores penetrantes deben ser retirados de los embriones, e inmediatamente, estos deben rehidratarse, por lo que se debe utilizar un buffer osmótico, en una concentración suficiente para alcanzar una osmolaridad ligeramente inferior a la de la solución de vitrificación, para mantener el equilibrio entre la presión osmótica interna y externa. Estas sustancias buffer son no permeables como la Sacarosa (1M), Sucrosa (0.5 M). El tiempo de exposición del embrión con las soluciones hiperosmóticas decrecientes varía entre 3 y 5 min por paso (MARTINEZ 2006). Este shock osmótico puede ser sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de permeabilidad como el etilenglicol EG.
Otros autores como Díez, C, et al, 2004 destacan que la desvitrificación requiere diluir y retirar el agente crioprotector antes de transferir el embrión. Los embriones pueden ser diluidos a través de dos métodos, bien sea dilución dentro o fuera de la pajuela. (VAJTA 2000).
Para la dilución fuera de la pajuela (ex-straw dilution), los embriones son colocados en placas que contienen sucrosa 0,2 M y luego de 5 min se trasladan a una solución de 0,1 M de sucrosa por 5 min, seguido de dos lavados en medio de mantenimiento, colocando los embriones en pajuelas de 0.25ml para su posterior transferencia.
Las condiciones de manipulación (temperatura ambiental -39ºC, temperatura de las soluciones de desvitrificación -41ºC-, dilución en soluciones con concentraciones decrecientes de sacarosa) son difíciles de establecer en las granjas, extremo muy importante en el caso del ganado vacuno.
El porcentaje de receptoras gestantes, diagnosticadas por ecografía, fue de 64% (7 de 11) para el método de dilución dentro de la pajuela y 40% (4 de 10) para el método de dilución fuera de la pajuela. (CABRERA 2006)
La etapa de desarrollo del embrión más apropiada para la vitrificación en Etilen Glicol es la mórula compacta y blastocisto temprano tanto en los producidos in vivo como in vitro. Otro aspecto a considerar es la calidad de los embriones a vitrificar, ya que cuando se congelan embriones de buena calidad, se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular.
Para elegir el mejor método de vitrificación se den tomar en cuenta diferentes factores con: Crioprotectores a utilizar, estos deben manejarse en adecuada concentración, adicionarse al embrión en forma creciente y a tiempos determinados, en combinación con otros rioprotectores que sean de baja toxicidad, para que sean utilizados con el menor volumen posible. Temperatura de adición con tasas de enfriamiento lo suficientemente rápidas para evitar la pérdida del equilibrio osmótico y causar daño celular que comprometa la viabilidad embrionaria. (CELESTINOS).
Con respecto a la vitrificación, puede concluirse que los resultados de la viabilidad poscongelado varian según el protocolo y la metodología de la obtención de los embriones. Debido al desarrollo de la técnica de FIV y su cada vez mayor utilización en Programas de Fertilización Asistida, se han desarrollado y modificado en el tiempo muchos Protocolos y Técnicas cuya aplicabilidad depende del estado de desarrollo embrionario, los crioprotectores utilizados y en gran medida de la habilidad y destreza del personal especializado
FASE DE EQUILIBRIO
Respecto
al primer paso de Exposición del embrión a la solución de equilibrio (SE), los embriones obtenidos entran en contacto
con un medio de mantenimiento antes de ponerse en contacto con la solución
vitrificante.
En esta fase el contacto del embrión con los crfioprotectores se efectúa en varios pasos, según el protocolo utilizado.
La Solución de Equilibrio (SE) está compuesta por una Solución Básica (SB) con un pH estable que oscila entre 7.2 y 7.4, suplementada con bajas concentraciones de crioprotectores y diferentes tiempos de exposición, habiendose reportado valores de 1,5 minutos (VAJTA), 5 min (MARTINEZ 2002; VARAGO 2006; HUANG 2007), 7 minutos (DOBRINSKY) o 10 minutos (MARTINEZ 2006).
Dentro de la Soluciones Básicas (SB) de medios de cultivo tenemos:
- Medio de Cultivo de Tejido TCM199
- Medio HEPES-buferado
- Ham F-10
- TCM 199 +HEPES
- EFS (CABRERA 2006)
- Medio de Cultivo de Tejido TCM199
- Medio HEPES-buferado
- Ham F-10
- TCM 199 +HEPES
- EFS (CABRERA 2006)
- Medio Base (MB) = TCM‐199 w/ y rojo fenol (Cellgro) + 10% Suero Fetal Bovino (SFB) + 5ml/ml Gentamicina. (BONILLA 2011)
Sin embargo, el medio simple de Buffer Fosfato Salino (PBS) es el más utilizado, no presentando diferencia significativa en la tasa de reexpansión y eclosión embrionaria con el complejo medio TCM-199 (VAJTA). Otros autores reportan una mayor tasa de desarrollo in vitro en embriones vitrificados con medio a base de PBS suplementado con un medio h-CM (SILVESTRE 2003).
Las Soluciones de Equilibrio están compuestas por Soluciones Básicas mezcladas con los diferentes crioprotectores en menores proporciones que las Soluciones Vitrificantes
- G10% + PG 20% en PBS (SHEFFEN)
- DMSO 10% + EG 10% en WS (HAJARIAN 2011)
- EG 7.5% + DMSO 7.5% (BONILLA 2011)
- DMSO 5% (v/v) EG 5% (v/v) en DPBS (CALOMARDE 2014)
- EG 10% + DMSO 10% (vol/vol) disueltos en SB de PBS Dulbecco suplementada con 0.2% de Sero Albúmina Bovina SAB (vol/vol) (JIMENEZ 2016)
Se ha reportado la
exposición del embrión en un solo paso (WALKER 2006), dos pasos (VAJTA)
y tres pasos (DONNAY).
Los
resultados indican que al aumentar el número de pasos de equilibrio antes de la
inmersión final en la solución de vitrificación, la viabilidad de los embriones
es mayor después de la desvitrificación. Este incremento gradual en la
concentración del crioprotector permite que se disminuya el estrés osmótico y
el daño celular; sin embargo, el número
de pasos en la fase de equilibrio es uno de los puntos críticos que aún impiden
que la vitrificación sea utilizada a nivel comercial, ya que el tiempo en cada
uno de los pasos puede retrasar el proceso, cuando se trata de vitrificar un
número elevado de embriones. (MANJUNATHA 2009)
WALKER 2006 evaluaron las tasas de viabilidad de los embriones in vitro, comparando procesos en los que se adicionaba el crioprotector, en uno o dos pasos. Las tasas de viabilidad embrionaria con un paso fueron inferiores a las obtenidas con dos pasos (85% vs 98%, respectivamente); por lo tanto, el simplificar este proceso para hacerlo en una forma más rápida podría ser inadecuado, para la posterior viabilidad de los embriones.
FASE DE VITRIFICACION
WALKER 2006 evaluaron las tasas de viabilidad de los embriones in vitro, comparando procesos en los que se adicionaba el crioprotector, en uno o dos pasos. Las tasas de viabilidad embrionaria con un paso fueron inferiores a las obtenidas con dos pasos (85% vs 98%, respectivamente); por lo tanto, el simplificar este proceso para hacerlo en una forma más rápida podría ser inadecuado, para la posterior viabilidad de los embriones.
FASE DE VITRIFICACION
Con
relación al segundo paso: Contacto del embrión con la solución vitrificante, después de la fase de equilibrio, la SV contiene altas
concentraciones de crioprotector, pero el tiempo de contacto del embrión con el crioprotector
disminuye considerablemente, puesto que existe un límite biológico en la
tolerancia de las células al crioprotector, para evitar su toxicidad y la formación
de cristales de hielo. El tiempo de
exposición de los embriones con la SV varía entre los reportes dependiendo de
los crioprotectores utilizados y el tipo de embrión a vitrificar (mórula o
blastocisto).
El
periodo de contacto del embrión con la solución vitrificante oscila entre 20-60
segundos (VARAJO 2006; HUANG J. 2007; MANJUANATHA 2009).
Dentro de las Soluciones Vitrificantes se han empleado:
- EG20% + DMSO20%
- EG 12.5% + DMSO 12.5% + PBS 75%
- DMSO 20% + EG20% + Sucrosa 0.5M en WS (HAJARIAN 2011)
- EG 16.5% + DMSO16.5% en Medio Base MB (BONILLA 2011)
- EG 42,5% (v/v) DEXTRANO 18% (peso/v), SA 1,01M CAROSA en PBSD (CALAMARDE 2014)
- Medio EFS compuesto por EG40%+ FICOL70 18% + SUCROSA 0.3M en Medio
Independiente CO2 (CIM, Gibco BRL) (CHRENEK 2014)
Dentro de las Soluciones Vitrificantes se han empleado:
- EG20% + DMSO20%
- EG 12.5% + DMSO 12.5% + PBS 75%
- DMSO 20% + EG20% + Sucrosa 0.5M en WS (HAJARIAN 2011)
- EG 16.5% + DMSO16.5% en Medio Base MB (BONILLA 2011)
- EG 42,5% (v/v) DEXTRANO 18% (peso/v), SA 1,01M CAROSA en PBSD (CALAMARDE 2014)
Independiente CO2 (CIM, Gibco BRL) (CHRENEK 2014)
Con referencia al tercer paso empaque del embrión, se han diseñado varias técnicas para el almacenamiento de los embriones vitrificados, las cuales mantienen el embrión en contacto estrecho con el nitrógeno líquido, con el fin de obtener tasas altas de enfriamiento y alcanzar el estado vítreo. Estas técnicas
permiten el uso de pequeños volúmenes de crioprotector, con la consecuente
disminución de la embriotoxicidad. (RIOS)
Las técnicas de empaque de los embriones ha evolucionado ampliamente desde el empaque en pajilla plástica convencional de 0.25 cc, pasando luego al empleo de la Pajilla Abierta Estirada o Técnica OPS (Open Pulled Straw). Con posterioridad se han desarrollado otras técnicas de empaque como el "CRYOTOP", "CRYOLOOP" (KUWAYAMA 2005; LUCENA 2006), el McGILL CRYOLEAF (HUANG 2007), la Super Pajilla Abierta Estirada (Super Open Pulled Straws; SOPS) (YU 2010).
Al minimizar el volumen de la solución de vitrificación en la que están los oocitos o embriones, se aumentan las tasas de enfriamiento y calentamiento, disminuyendose la formación de cristales de hielo. También se disminuye el daño por chilling que ocurre entre los +15 °C y los -5°C al pasar la muestra rápidamente por este rango de temperatura. La tasa para evitar este daño debe ser de unos 20.000 C/min. Aparentemente con Cryotop se consigue una tasa de hasta 40.000 C/min.
Al utilizar un volumen mínimo de Solución Vitrificante SV de 0.1 ml, al cargar la lámina, se evita el daño por fractura de la zona pelúcida y las membranas celulares, daño que es relativamente común con la congelación por métodos convencionales.
TECNICA PAJILLA 0.25 ml
Las técnicas de empaque de los embriones ha evolucionado ampliamente desde el empaque en pajilla plástica convencional de 0.25 cc, pasando luego al empleo de la Pajilla Abierta Estirada o Técnica OPS (Open Pulled Straw). Con posterioridad se han desarrollado otras técnicas de empaque como el "CRYOTOP", "CRYOLOOP" (KUWAYAMA 2005; LUCENA 2006), el McGILL CRYOLEAF (HUANG 2007), la Super Pajilla Abierta Estirada (Super Open Pulled Straws; SOPS) (YU 2010).
Al minimizar el volumen de la solución de vitrificación en la que están los oocitos o embriones, se aumentan las tasas de enfriamiento y calentamiento, disminuyendose la formación de cristales de hielo. También se disminuye el daño por chilling que ocurre entre los +15 °C y los -5°C al pasar la muestra rápidamente por este rango de temperatura. La tasa para evitar este daño debe ser de unos 20.000 C/min. Aparentemente con Cryotop se consigue una tasa de hasta 40.000 C/min.
Al utilizar un volumen mínimo de Solución Vitrificante SV de 0.1 ml, al cargar la lámina, se evita el daño por fractura de la zona pelúcida y las membranas celulares, daño que es relativamente común con la congelación por métodos convencionales.
TECNICA PAJILLA ABIERTA ESTIRADA OPS
El tercio central de la pajilla es apoyado y calentado por 30 segundos sobre la esquina de una placa térmica a 90°C, hasta el evidente reblandecimiento del plástico. Una vez logrado esto, ambos extremos son traccionados en un plano horizontal hasta lograr en la porción central la reducción del diámetro del grosor de la pared.
Luego, se cortan las pajillas con un bisturí en la sección delgada, para ser esterilizadas utilizando luz ultravioleta y almacenadas hasta su utilización. El volumen de solución crioprotectora que contendrá el extremo delgado de la pajilla será de 2µl, correspondientes al volumen de la gota desde la cual el embrión será cargado por capilaridad (SILVA 2004)
En la actualidad se cuenta con OPS ® MINITUB, producidas comercialmente.
Al evaluar esta técnica de vitrificación OPS en embriones bovinos producidos in vivo, se obtuvo una tasa de reexpansión del 84,6% (33 de 39) y una tasa de eclosión del 66,6% (26 de 39; , mientras que embriones bovinos producidos in vitro presentaron una tasa de reexpansión de 52% (27 de 52).(SAALFELD 2002)
Sin embargo, esta exposición directa con el nitrógeno y la posibilidad de contaminación con patógenos virales durante el almacenamiento obligaron a desarrollar nuevos Sistemas de Almacenamiento Cerrado CPS, eliminando el riesgo de contaminación. (BIELANSKI 2003)
A partir de allí, se desarrollaron otras técnicas con el fin de reducir el volumen del crioprotector utilizado en la vitrificación.
TECNICA "CRYOTOP"
"CRYOTOP ® " (KITAZATO COM, Fuji Japan)
El Cryotop ® es un método de vitrificación de volumen mínimo. Está compuesto por una lámina especial de polipropileno delgado y estrecho (0.4 mm de ancho, 20 mm de largo, 0.1 de espesor) unida a soporte plástico duro. Con el fin de proteger el soporte del daño mecánico durante el empaque, se protege con una funda plástica larga de 3 cm; en esta funda se inserta la lámina de propileno.
El CRYOTOP® con un volumen de 0.1 μl enfría a un promedio de 69.25 ± 4,280°C/min de 20°C a - 120°C cuando se introduce directamente en nitrógeno líquido y se calienta desde los −170°C to −30°C a un promedio de 117,500 ± 10,630°C/min, cuando se transfiere abruptamente del nitrógeno líquido a una solución de 2 ml de Sucrosa a 23°C.
Con base en los resultados de altas tasas de supervivencia y desarrollo en la gran mayoría de las especies como Porcinos (USHIJIMA 2004), Bovinos (MORATO 2008), Murinos (LING 2009), Búfalos (LIANG 2012), Humanos (ROY 2014) y Conejos (MARCO-JIMENEZ 2016), el método CRYOTOP® ha sido considerado como la llave maestra de la vitrificación. (MARCO-JIMENEZ 2016)
Con el método de Cryotop se puede utilizar una gran variedad de medios de equilibrio, vitrificación, dilusión, de acuerdo a los requisitos específicos de cada especie o el estado de desarrollo del embrión, así como el criterio y experiencia del Profesional.
En general una proporción equimolar de EG y DMSO suministra una combinación efectiva, usando un método de equilibrio y vitrificación en varios pasos y una suplementación de sacarosa en la concentración final de desvitrificación. El EG es considerado como un componente estandar de las soluciones de vitrificación de mayor éxito. La combinación con DMSO se utilizó por primera vez por Ishimori y colaboradores, observandose un aumento de la permeabilidad del EG. (VAAMONDE 2010)
Con el CRYOTOP ® se han desarrollado dos técnicas de empaque, el Sistema Abierto y el Sistema Cerrado (CRYOTOP ® SC), el cual permite el sellado del dispositivo dentro de una pajilla completamente cerrada, con el fin de efectuar la vitrificación sin que el CRYOTOP ® entre en contacto con el nitrógeno líquido.
https://www.youtube.com/watch?v=TUPfZhP64IA
TECNICA DE "CRYOLOOP" O CPIL (CALIBRATED PLASTIC INOCULATION LOOP)
TECNICA DE "CRYOLOOP" O CPIL (CALIBRATED PLASTIC INOCULATION LOOP)
"CRYOLOOP" (CPIL, DELTALAB, Rubí, Spain)
El Cryoloop o CPIL está compuesto por un dispositivo de plástico suave flexible desechable (nylon), de 0.5 a 0.7 mm de diámetro, junto con una funda, de un vial de congelación. Este dispositivo es un asa utilizada en microbiología para recolectar y sembrar muestras de un cultivo de microorganismos. (SAKI 2005)
Actualmente son fabricados en polipropileno grado médico, esterilizado mediante gases de óxido de etileno.
Son libres de lubricantes, aceites o cargas electrostáticas. Esta dentro de una bolsa plástica individual. Además el asa está cubierta por una funda de plástico (pajilla de 3 cm de largo y 0.5 ml) en la punta de la lámina del Cryoloop, para protegerlo durante el almacenamiento en el termo de nitrógeno, de acuerdo con las regulaciones de la UE.(MARCO-JIMENEZ 2016).
Mientras los embriones son expuestos a las soluciones crioprotectoras, el «cryoloop» es sumergido en la solución crioprotectora, creando una película delgada en el asa de polipropileno. Luego, los embriones son capturados en dicha película y transferidos hasta el vial, el cual ha sido sumergido y llenado previamente con nitrógeno líquido. (LANE)
Por medio de esta técnica Mukaida et al. reportan 79% de supervivencia post vitrificación en blastocitos humanos. Posteriormente, se han publicado nuevas variantes de esta técnica, denominando a la nueva versión «cryoloop-straw», con la cual se han reportado resultados similares a las obtenidos con la técnica «cryoloop» convencional.
En un estudio realizado por MARCO-JIMENEZ 2016, se comparó la eficiencia de la vitrificación de embriones in vitro de conejas, mediante el empleo de dispositivos Cryotop, Cryoloop y embriones frescos, en cuanto a la tasas de desarrollo e implantación, tasa de nacimientos al parto y perdidas embrionarias y fetales, encontrándose que la tasa de eclosión de embriones in vitro fueron similares. Igualmente se confirmó que la técnica de Crotop y Cryoloop son iguales de efectivas en cuanto a tasas de preñez y nacimientos al parto, resultados que son similares a otros estudios previos.
Adicionalmente, los resultados obtenidos en este estudio sobre el efecto de estos dispositivos en relación con las pérdidas embrionarias y fetales mostraron que no hay diferencia significativa entre Cryotop y Cryoloop. Sin embargo, las perdidas embrionarias fueron mayores en los grupos vitrificados con relación al grupo de embriones en fresco. Se encontró así mismo, un pico de pérdidas embrionarias después de la vitrificación y antes de la implantación, pero después de la implantación hasta el final de la gestación, ambos grupos de dispositivos y el grupo de frescos se comportaron de forma similar.
Además de los sistemas de empaque descritos se han desarrollado otros como
- Tamaño Mínimo de la Gota (MDS)
- Rejillas para Microscopía Electrónica (EM)
- Volumen Mínimo de Congelación (MVC)
- Sistema de Hemi-pajilla (SHP)
- Superficie Sólida de Vitrificación. (SSV)
- Puntas gel-loading tips.
- Pajillas Estiradas Cerradas closed-pulled straws (CPS)
- Mallas de nylon
- Pipetas Flexibles, flexipet denuding pipette (FDP)
- Pajillas Estiradas Abiertas Superfinas superfinely OPS
(SOPS)
- Micropipetas Plásticas de Diámetro Fino.
-Puntas de Pipeta de 100 μL (RODRIGUEZ 2010)
demostraron esta eficiencia, al alcanzar mayores tasas de congelamiento con micropipetas de vidrio (GMP) en comparación con las OPS, y mayores tasas de supervivencia post-vitrificación, debido a una mayor conductividad y la utilización de un menor volumen de crioprotectores. (RODRIGUEZ 2011)
Al evaluar la viabilidad de los embriones utilizando sistemas abiertos (OPS) vs sistemas cerrados (SOPS), YU et al. 2010 no encontraron diferencias significativas en las tasas de viabilidad a las 72 horas post-vitrificación, 35,2% y 34,9%, respectivamente.
FASE DE CALENTAMIENTO - DESVITRIFICACION - DESCONGELACION
Para la denominación de este proceso en los protocolos de vitrificación, se han empleado los términos descongelación, desvitrificación y calentamiento. Cuando se habla de llevar nuevamente el material biológico vitrificado a la temperatura ambiente del laboratorio se utiliza el término calentar y no descongelar. Por otra parte, desvitrificación no significa, como parecería, salir del estado de vitrificación para regresar a la temperatura óptima celular o corporal, sino que indica pérdida del estado vítreo pasando al de cristalización, hecho indeseable que puede ser incompatible con la viabilidad celular y embrionaria (CABODEVILA 2001 SHAW 2003)
Estos procesos tienen como finalidad llevar el ovocito o embrión a su estado estructural antes de la vitrificación. Teniendo en cuenta lo anterior puede considerarse esta fase como una restitución de las células a su estado natural, por lo que se sugiere emplear este término para denominar este paso.
Antes de realizar la transferencia, los crioprotectores utilizados deben ser retirados en forma lenta de los embriones, ya que, una vez en contacto con los fluidos uterinos isotónicos, se produce una sobrehidratación que provoca daños celulares irreversibles con ruptura de la membrana celular y la posterior muerte embrionaria. Este shock osmótico puede ser sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de permeabilidad como el etilenglicol. (CABRERA et al. 2006).
Una vez calentadas las pajuelas, los crioprotectores penetrantes deben ser retirados de los embriones, e inmediatamente, estos deben rehidratarse, por lo que se debe utilizar un buffer osmótico, en una concentración suficiente para alcanzar una osmolaridad ligeramente inferior a la de la solución de vitrificación, para mantener el equilibrio entre la presión osmótica interna y externa. Estas sustancias buffer son no permeables como la Sacarosa (1M), Sucrosa (0.5 M). El tiempo de exposición del embrión con las soluciones hiperosmóticas decrecientes varía entre 3 y 5 min por paso (MARTINEZ 2006). Este shock osmótico puede ser sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de permeabilidad como el etilenglicol EG.
Otros autores como Díez, C, et al, 2004 destacan que la desvitrificación requiere diluir y retirar el agente crioprotector antes de transferir el embrión. Los embriones pueden ser diluidos a través de dos métodos, bien sea dilución dentro o fuera de la pajuela. (VAJTA 2000).
En la Técnica OPS, para la dilución dentro de la pajuela (in-straw dilution) se utiliza una pajilla de 0.25 ml conteniendo sucrosa 0,2 M, calentada a 39ºC y mantenida verticalmente con el extremo abierto hacia arriba. OPS es sacada del nitrógeno líquido, y el extremo angosto, que contienen el embrión y solución, es deslizado dentro de la pajilla de 0.25 ml. , sumergiendo el embrión en la solución de sucrosa, retirando enseguida la OPS. La pajilla de 0.25 ml es cargada en una pistola para realizar la transferencia en la receptora
Para la dilución fuera de la pajuela (ex-straw dilution), los embriones son colocados en placas que contienen sucrosa 0,2 M y luego de 5 min se trasladan a una solución de 0,1 M de sucrosa por 5 min, seguido de dos lavados en medio de mantenimiento, colocando los embriones en pajuelas de 0.25ml para su posterior transferencia.
Las condiciones de manipulación (temperatura ambiental -39ºC, temperatura de las soluciones de desvitrificación -41ºC-, dilución en soluciones con concentraciones decrecientes de sacarosa) son difíciles de establecer en las granjas, extremo muy importante en el caso del ganado vacuno.
El porcentaje de receptoras gestantes, diagnosticadas por ecografía, fue de 64% (7 de 11) para el método de dilución dentro de la pajuela y 40% (4 de 10) para el método de dilución fuera de la pajuela. (CABRERA 2006)
PROTOCOLOS DE VITRIFICACION
TECNICA OPEN PULLED STRAW - OPS
1.- Los embriones son sacados de la incubadora y retirados de las microgotas de cultivo.
2.- Luego del retiro los embriones son lavados en una caja de Petri precalentada que contiene una solución compuesta por TCM199 (SIGMA) + SFB 20% (PBS - GIBCO) para retirar la mayor cantidad de aceite de la gota de cultivo.
3.- Una vez lavado el embrión es depositado en la Solución de Equilibrio SE compuesta por TCM199, SFB 20% + EG 10% + DMSO 10%, a una temperatura
de 39°C por 1 minuto.
Enseguida el embrión es trasladado y depositado en la SV compuesta por TCM199 + SFB 20% + EG 20% + DMSO 20% a una temperatura de 39°c por 3 minutos.
4.- Desde esta solución el
embrión es tomado con una pipeta automática, en un volumen de 2µl,
depositándose esta gota sobre el fondo de una placa Petri.
Con una pajilla plástica previamente estirada o de uso comercial, por el extremo más delgado se carga por capilaridad la pajilla. OPS
5.- Inmediatamente después la pajilla es sumergida en nitrógeno líquido, medio en el cual se mantienen los embriones hasta su descongelación, evaluación y transplante.
6.- Para el calentamiento se preparan y depositan en una caja de Petri las Soluciones de Descongelación SD y el embrión contenido en la pajilla con medio de descongelación.
Luego el embrión es trasladado a la SD1 = TCM199 + Sucrosa 0.3M durante 5 minutos.
Posteriormente se traslada el embrión a la SD2 = TCM199 + Sucrosa 0.15M durante 5 minutos. Enseguida el embrión se traslada a la SD3 = TCM199 + SFB 20% para su lavado final y ser montado en una pajilla de 0.5 ml o 0.25 ml y ser trasplantado a la receptora.
En el caso de procesos de investigación sobre el análisis de viabilidad, tasa de reexpansión o eclosión los embriones son depositados en microgotas de cultivo de 50µl del medio escogido por el investigador en el protocolo, para tal efecto.
A manera de información y por considerarlo interesante, me permito trascribir el siguiente Protocolo para OPS.
MEDIOS:
Después de eso tocar el lado izquierdo de la gota con la OPS, por el extremo final en un ángulo aproximado de 70 grados horizontal a la parte inferior, debe formarse un volumen de VS2 de aproximadamente 1 mm que contiene los embriones
Completar este paso en 25 segundos.
- Seque el Cryopette con una toalla de papel y colóquelo en el soporte de corte
- Efectúe el corte con la cuchilla a nivel de la marca de sellado
TECNICA OPEN PULLED STRAW - OPS
1.- Los embriones son sacados de la incubadora y retirados de las microgotas de cultivo.
2.- Luego del retiro los embriones son lavados en una caja de Petri precalentada que contiene una solución compuesta por TCM199 (SIGMA) + SFB 20% (PBS - GIBCO) para retirar la mayor cantidad de aceite de la gota de cultivo.
de 39°C por 1 minuto.
Enseguida el embrión es trasladado y depositado en la SV compuesta por TCM199 + SFB 20% + EG 20% + DMSO 20% a una temperatura de 39°c por 3 minutos.
Con una pajilla plástica previamente estirada o de uso comercial, por el extremo más delgado se carga por capilaridad la pajilla. OPS
5.- Inmediatamente después la pajilla es sumergida en nitrógeno líquido, medio en el cual se mantienen los embriones hasta su descongelación, evaluación y transplante.
Luego el embrión es trasladado a la SD1 = TCM199 + Sucrosa 0.3M durante 5 minutos.
Posteriormente se traslada el embrión a la SD2 = TCM199 + Sucrosa 0.15M durante 5 minutos. Enseguida el embrión se traslada a la SD3 = TCM199 + SFB 20% para su lavado final y ser montado en una pajilla de 0.5 ml o 0.25 ml y ser trasplantado a la receptora.
En el caso de procesos de investigación sobre el análisis de viabilidad, tasa de reexpansión o eclosión los embriones son depositados en microgotas de cultivo de 50µl del medio escogido por el investigador en el protocolo, para tal efecto.
A manera de información y por considerarlo interesante, me permito trascribir el siguiente Protocolo para OPS.
PROTOCOLO DE VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS EN PAJILLA ABIERTA
Procedures for In Vitro Production of Bovine Embryos‐ University Florida
L. Bonilla, J. Block, and P. J. Hansen
Dept. of Animal Sciences, University of Florida and Ovatech LLC
Este protocolo es una adaptación del protocolo de Gabor Vajta. 2011
MEDIOS:
o Medio Base (MB): TCM‐199 w/ y rojo fenol (Cellgro) + 10% Suero Fetal Bovino (SFB) + 5
mg/ml Gentamicina;
o Medio Sacarosa MS: 1M Sacarosa (Fisher S‐5) disolver en MB;
o Etilenglicol EG: Sigma Aldrich (102466);
o Dimetilsulfoxido DMSO: Sigma Aldrich (D2650);
o DE VITRIFICACION:
Añadir a una placa de cuatro pozos las siguientes soluciones:
Añadir a una placa de cuatro pozos las siguientes soluciones:
o Pozo 1: MB 800 ml
o Pozo 2: MB 800 ml
o Pozo 3: MB 850 ml + EG 75 ml + DMSO 75 ml (VS1)
o Pozo 4: MS 670 ml + EG165 ml + DMSO 165 ml (VS2)
o Mezclar la solución 3 y 4 utilizando un pipeteador
o DE DESCONGELAMIENTO:
Añadir a una placa de cuatro pocillos las siguientes soluciones:
Añadir a una placa de cuatro pocillos las siguientes soluciones:
o Pozo 1: MB 800 ml, MS 400 ml
o Pozo 2: MB 800 ml, MS 400 ml
o Pozo 3: MB 800 ml, MS 200 ml
o Pozo 4: MB 800 ml,
o Mezclar la solución 1 y 3 utilizando un pipeteador
o PROCESO DE VITRIFICACIÓN:
o Cubrir la placa y calentar por 5 o 10 minutos en incubadora.
o Colocar los embriones en el pozo 1, transferirlos con la menor cantidad de aceite
mineral que los cubre en los pozos de cultivo.
o Después de aproximadamente 1 minuto, transferir los embriones al pozo 2, este
pozo se utiliza de almacenamiento mientras se vitrifican los embriones paso a paso.
pozo se utiliza de almacenamiento mientras se vitrifican los embriones paso a paso.
o Colocar una gota de 20 ml en el centro de una placa de 4 pozos, hacia el lado derecho y
parte inferior de la placa de 4 pozos.
parte inferior de la placa de 4 pozos.
o Transferir de 1 a 10 embriones en el pozo 3, con un mínimo volumen de medio por 3 minutos.
o Transferir los embriones en el menor volumen posible a la gota de 20 ml.
Aspirando y expulsando tomar el embrión en aproximadamente 2 ml de volumen, hacer una pequeña gota a la izquierda del centro e inferior de la placa de 4 pozos
Aspirando y expulsando tomar el embrión en aproximadamente 2 ml de volumen, hacer una pequeña gota a la izquierda del centro e inferior de la placa de 4 pozos
Después de eso tocar el lado izquierdo de la gota con la OPS, por el extremo final en un ángulo aproximado de 70 grados horizontal a la parte inferior, debe formarse un volumen de VS2 de aproximadamente 1 mm que contiene los embriones
Completar este paso en 25 segundos.
o Sumergir la pajilla en nitrógeno líquido en un movimiento que pase rápido por el vapor, la pajilla debe permanecer casi horizontal, luego colocarla verticalmente.
o Para almacenarla en el termo de nitrógeno líquido se sugiere introducir el OPS dentro de una pajilla de 0.5 ml etiquetando y cerrando la pajilla.
o Para almacenarla en el termo de nitrógeno líquido se sugiere introducir el OPS dentro de una pajilla de 0.5 ml etiquetando y cerrando la pajilla.
o Después de 2 o 3 ciclos de vitrificación hacer otra gota de 20 ml de medio.
o PROCESO DE DESCONGELACION:
o Coloque uno de los 4 pozos de la placa en el microscopio (lámpara).
o Sacar la pajilla del nitrógeno líquido sostener con los dedos pulgar, índice y medio.
o En 5 segundos sumergir la pajilla en el pozo visto al microscopio en un ángulo de 30 a 45 grados (relación horizontal), pero sumerja el total la columna de líquido vitrificado conteniendo el (los) embrión (es).
o Inmediatamente después que la columna de solución vitrificada se disuelve, el medio del pozo comienza entrar a la pajilla. En este momento, cerrar el extremo abierto de la pajilla con el dedo índice, posteriormente dejar salir la solución antes vitrificada de la pajilla.
o En raras ocasiones queda un remanente de solución en la pajilla, en este caso se adaptará un pipeteador al extremo abierto para vaciarla.
o Inmediatamente después transferir los embriones al pozo 2, (se realiza la transferencia semi‐directa, en este momento se carga (n) el (los) embrión (es) en la (s) pajilla (s).para transferencia
Otra manera es seguir los dos pasos siguientes
Otra manera es seguir los dos pasos siguientes
o Después de 5 minutos, transferir los embriones al pozo 3 luego de otros 5 minutos
cambiarlos al pozo 4.
o Colocar los embriones en el plato apropiado para cultivarlos por 2 horas para luego ser transferidos..
o PROCESO DE DESCONGELACION Transferencia Semi ‐ Directa:
o Este procedimiento requiere de solo un embrión vitrificado en la OPS
o Repetir el procedimiento descrito anteriormente descongelar y transferir
embriones en pozo 2.
o Inmediatamente después, cargar el embrión en pajilla de 0.25 ml utilizando el medio
del pozo 2 y realizar la transferencia. (ver TE protocolo de transferencia de embriones).
o La transferencia debe realizarse no más de 5 minutos de descongelados los embriones.
TECNICA "CRYOPETTE"®
https://www.youtube.com/watch?v=rdbwDVB8cHk
Esta técnica de sistema cerrado, utiliza un dispositivo delgado y de bajo volumen, en el cual se reemplaza la micropipeta por un bulbo de desplazamiento, que facilita el manejo del embrión en su proceso de vitrificación.
La criopajilla muestra marcas de corte, sellado y bordes distal y proximal, entre los cuales debe situarse el embrión.
Contiene un bulbo mediante el cual se saca el aire y aspira el medio y el embrión.
PREPARACION ANTES DEL PROCESO DE ENFRIAMIENTO.
Contiene un bulbo mediante el cual se saca el aire y aspira el medio y el embrión.
PREPARACION ANTES DEL PROCESO DE ENFRIAMIENTO.
- Marque la muestra con la etiqueta alrededor del bulbo.
- Prepare el medio de acuerdo al protocolo de vitrificación elegido
- Prepara el cryotermo con nitrógeno líquido junto con la gradilla y el gobelet de almacenamiento.
- Pruebe el bulbo de la pajilla
- Prepare el sellador de pajillas.
- Retire de la incubadora la caja de Petri con los embriones.
- Corte la pajilla por delante de la marca de sellado.
- Aspire medio hasta la marca de sellado.
- Aspire el embrión hasta que quede posicionado entre las marcas del borde distal y proximal.
- Es importante que el embrión sea aspirado con el bulbo en una columna continua de medio.
- Si se observan burbujas de aire expulselas y cargue de nuevo
- Colocar la pajilla en el sellador
- Se sella a nivel de la marca de sellado
- Revise al microscopio el sellado.
- Deposite el (los) Cryopette (s) en el goblet dentro del nitrógeno líquido.
- Cubra el goblet con un tubo plástico
- Luego transfiera el goblet al Termo de Almacenamiento
PROCESO DE CALENTAMIENTO
- Prepare el equipo de calentamiento
- Llene el Termo Refrigerador con nitrógeno líquido
- Llene el recipiente de calentamiento con agua a 37°C, mínimo 250 ml.
- Prepare el soporte y la cuchilla de corte
- Caliente el medio a 37°C y deposite una gota de 2 ml en una caja de Petri precalentada, para recibir los embriones luego del calentamiento del Cryopette
- Retire del Termo de Almacenamiento el goblet con los Cryopettes para calentar
- Retire el Cryopette del goblet en el termo refrigerador.
- Tómelo con los dedos y gírelo suavemente hasta que se vuelva flexible. Mínimo 15 segundos
- Transfiera el goblet del nitrógeno líquido al agua a 37°C, lo cual se debe realizar en menos de 1 segundo
- Mantenga sumergido el goblet dentro del agua a 37°C durante 2 segundos.
- El porcentaje de calentamiento es de >30.000C/min si se siguen correctamente las recomendaciones.
- Seque el Cryopette con una toalla de papel y colóquelo en el soporte de corte
- Efectúe el corte con la cuchilla a nivel de la marca de sellado
- Si el bulbo no está suficientemente calentado, puede entrar aire al abrir el Cryopette.
- Si el bulbo está congelado o muy frío, la columna de medio puede fragmentarse por la entrada de aire.
- Si hay aire atrapado, retire las burbujas lejos de la gota de medio precalentado.
- Retire medio de la pajilla hasta aproximar los embriones a la punta del Cryopette.
- Deposite los embriones en la gota de medio precalentada.
- Cargue la pajilla con el embrión para ser transplantado.
- Si hay aire atrapado, retire las burbujas lejos de la gota de medio precalentado.
- Retire medio de la pajilla hasta aproximar los embriones a la punta del Cryopette.
- Deposite los embriones en la gota de medio precalentada.
- Cargue la pajilla con el embrión para ser transplantado.
TECNICA CRYOTOP ® (KITAZATO COM, Fuji Japan).
MATERIALES Y EQUIPO
- Vial Medios de Vitrificación.
- Sol. Equilibrio1x1.5ml SE
- Sol. Vitrificación1x1.5 ml SV1
- Sol. Vitrificación 1x1.5 ml SV2
- "Cryotop ®"
- "Cryotop ®" SC
- Placa de 6 Pozos
- Termo de Enfriamiento
- Pipeta Pasteur
- Micropipetas 2 - 20 µl
- Reloj Temporizador
- Pinzas
- Tijeras o Corta pajillas
- Bloque de Aluminio
- Sellador
- Termo de Almacenamiento
- Nitrógeno Líquido
- Cámara de Flujo Laminar bajo la cual se desarrollaran los diferentes procesos.
FASE DE PREPARACION
1.- Coloque los medios a temperatura ambiente 25-27°C
2.- Identifique y marque el número del embrión en la funda de la pajilla.Monte el "Cryotop"
3.- Introduzca el "Cryotop" en la funda.
4.- Coloque el soporte de aluminio dentro del termo de refrigerador desde el principio
5.- Llene con nitrógeno líquido hasta cubrir la parte superior del soporte de aluminio.
6.- Retire de la incubadora la caja de Petri que contiene los embriones en solución de cultivo.
FASE DE EQUILIBRIO
7.- Marque con SE -SV1 -SV2 la tapa de la placa de seis pozos.
Agite cada vial de las soluciones para homogenizar.
8.- Con la micropipeta deposite 300 µl de cada solución según corresponda e inmediatamente tape la placa
9 Revise el reloj temporizador para los pasos siguientes.
10.- Aspire el embrión en la punta de la pipeta Pasteur con un mínimo de medio y deposítelo en el fondo del pozo con SE.
El embrión desciende libremente a los 30 segundos.
El embrión comienza a encogerse y luego gradualmente retorna a su tamaño original con la penetración de la solución SE, lo cual indica que la Fase de Equilibrio se ha completado.
El tiempo de equilibrio recomendado para cada tipo de células es de:
- OOCITO 12 - 15 Min.
- 2 - 4 -8 CELULAS 10 - 15 Min
- MORULA O BLASTOCISTO 12 - 15 Min
Se recomienda para el equilibrio Blastocistos en el día 5
FASE DE VITRIFICACION
11.- Luego de completar la Fase de Equilibrio, aspire el embrión de la SE en la punta de la pipeta.
12.- Transfiera el embrión con un volumen mínimo de SE en el centro del pozo 2 con SV1. Deposite solamente el embrión.
13.- Expulse fuera del pozo la cantidad restante de SE dentro de la pipeta.
14.- Aspire SV1 fresco y expúlselo fuera del pozo.
Aspire SV1 fresco dentro de la micropipeta.
15.-Aspire con la micropipeta el embrión con SV1 y expulselo nuevamente dentro de SV1.
Revuelva rápidamente alrededor del embrión.
16.-Repita la aspiración-expulsión por tres veces y revuelva.
17.- Cambie cada vez la posición del embrión dentro de SV1.
Mueva la solución alrededor del embrión hasta que solamente permanezca la SV1 y visualmente desparezca la SE
18.- Expulse el SV1 restante en la micropipeta y bótelo fuera del pozo.
19.- Aspire SV2 fresco dentro de la micropipeta
20.- Aspire el embrión en SV1 en la punta de la micropipeta
21.- Transfiera el embrión a SV2 con un volumen mínimo de SV1. Revuelva alrededor del embrión.
22.- Cambie de lugar el embrión por dos veces con la micropipeta en SV2.
Este paso se completa cuando el embrión queda libre de SV1 en el tercer pozo y solamente se observa SV2. El embrión se ve encogido debido a la deshidratación.
FASE DE ALMACENAMIENTO "CRYOTOP" SA ®
23.- Retire el Cryotop de la funda. Sumerja la funda en el nitrógeno liquido.
24.- Aspire el embrión en SV2 en la punta de la micropipeta.
Deposite el embrión en la lámina del Cryotop por la parte de la marca negra, con un mínimo volumen de SV2 (< 0.1 µl).
Luego de depositar el embrión en la lámina remueva el exceso de SV2 utilizando la micropipeta para aspirar. Cuando hay varios embriones, haga una gota para cada uno de ellos.
25.- Sumerja el Cryotop directamente en el nitrógeno líquido.
26.- Sostenga la funda llena de nitrógeno líquido con las pinzas e inserte el Cryotop por el extremo laminar dentro de la funda.
27.- Fije el Cryotop girándolo con ambas manos en sentido contrario de la funda.
Mantenga el Cryotop montado dentro del nitrógeno líquido hasta que se transfiera al termo de almacenamiento.
No exponer al aire el Cryotop hasta la fase de descongelación.
"CRYOTOP" SC ®
28.- Sumerja la funda del Cryotop directamente en el nitrógeno líquido, sin llenarla.
Corte la funda del Cryotop a nivel de la marca negra.
29.- Inserte el Cryotop con el embrión dentro de la funda sin nitrógeno líquido dentro de ella.
30.- Selle la funda del Cryotop.
Al sellar tenga cuidado de no introducir nitrógeno líquido dentro de ella.
La temperatura se mantiene a -15°C a una altura de 2.5 cm por encima de la superficie del nitrógeno líquido.
31.- Para identificar la superficie del nitrógeno líquido observe la marca negra de la funda del Cryotop.
Precaución: Mantenga la funda del Cryotop dentro del nitrógeno líquido hasta que se transfiera a un termo de almacenamiento
"CRYOTOP" STC ®(Sistema Totalmente Cerrado). Consiste en insertar el Cryotop SC® sellado, sin entrar en contacto con el nitrógeno líquido, dentro de una segunda funda y sellarla nuevamente.
FASE DE CALENTAMIENTO
MATERIALES Y EQUIPO
VIAL DE MEDIOS
- Solución de Calentamiento ST 2x4 ml
- Solución Diluyente DS 1x4 ml
- Solución Lavado WS 1x4 ml
- Placa de 6 Pozos
- Caja de Petri x 2
- Termo Refrigerador
- Pipeta Pasteur
- Micropipetas 10 y 1000 µl
- Reloj Temporizador
32.- Caliente en la incubadora a 37°C el vial de TS en una Caja de Petri durante 1.5 Hs, con al menos 90 min antes del proceso
Las Soluciones DS y WS se mantienen a temperatura ambiente (25-27°C)Retire del Termo de Almacenamiento la canastilla que contiene el “CRYOTOP ®” correspondiente y deposítelo en el termo de enfriamiento con nitrógeno líquido.
Revise la etiqueta de identificación del “CRYOTOP ®”
Marque con DS, W y WS la Placa de 6 pozos. Agite suavemente los frascos de solución para homogenizar.
Deposite en cada pozo 300 µl de la solución correspondiente, según el caso.
33.- Retire de la incubadora el vial de TS y la caja de Petri y colóquelos cerca al microscopio. Agite suavemente los viales para homogenizar. Ajuste el foco del microscopio para observar el fondo de la caja de Petri con TS.
Revise el funcionamiento del reloj temporizador y colóquelo en 0.
34.- Retire de la canastilla la funda con el “CRYOTOP®” y colóquelo en la esquina del termo refrigerador con nitrógeno líquido.
Retire suavemente la funda del “CRYOTOP®” y colóquelo en la esquina del termo refrigerador, sin sacarlo del nitrógeno líquido.
35.- Retire el “CRYOTOP®” y sumérjalo rápidamente dentro de la caja de Petri con TS. Debe permanecer dentro 1 segundo.
36.- Ajuste el foco sobre la lámina del “CRYOTOP®” y localice el embrión.
37.- Un minuto después de sumergido el “CRYOTOP®” en TS, y que el embrión quede libre de la lámina, déjelo durante 3 minutos. Esto para que se reemplace gradualmente de TS a DS.
Con la pipeta Pasteur aspire suavemente el embrión. Al mismo tiempo aspire TS hasta que el embrión quede a 2 mm de la punta de la pipeta Pasteur.
38.- Deposite un poco de TS en el fondo de la SD junto con el embrión.
Déjelo durante 5 minutos.
Luego aspire DS hasta que el embrión quede a 2 mm de la punta de la pipeta.
39.- Transfiera el embrión al fondo del pozo que contiene WS1 y deposítelo con un volumen mínimo de DS.
Déjelo durante 5 minutos.
40.- Aspire el embrión con la punta de la pipeta junto con un volumen mínimo de WS1 y transfieralo al centro de la superficie del pozo que contiene WS2.
Cuando el embrión desciende al fondo del pozo con WS2, repita una vez más el paso anterior en WS2.
41.- Transfiera el embrión a una placa de cultivo que contenga el medio apropiado. Incube el embrión (es) a 37°C hasta completar su restitución al estado inicial. Se recomiendan 2 Hs de incubación.
Una vez restituido el embrión (es) aspírelo en una pajilla de 0.25 ml para ser transferido inmediatamente.
Los resultados presentados en los diferentes estudios muestra su gran variabilidad, lo que confirma una vez más la importancia que tiene el conocimiento de las bases fisiológicas reproductivas, la capacidad y destreza del Profesional que realiza los distintos procedimientos en cada una de las técnicas expuesta, así como también la importancia que tiene la calidad y confiabilidad de los medios utilizados en las mismas.
Lo anterior demuestra una vez más la gran variación existente entre las diferentes técnicas de criopreservación
CRIOPRESERVACION DE OVOCITOS
El ovocito es la célula más grande del organismo. Un ovocito maduro se caracteriza por su forma esférica, presentar el primer cuerpo polar en el espacio perivitelino y encontrarse en un estado de desarrollo de Metafase II, los cromosomas y el huso están libres en el citoplasma y las vesículas y los gránulos corticales están próximos a la membrana plasmática, rodeados por varias capas del Complejo Cúmulo Ooforo CCO, permaneciendo en este estado hasta que es fertilizado, momento en el cual se completa la meiosis y se forman los pronúcleos.
La criopreservación de ovocitos bovinos para su posterior fertilización in vitro es una TRA que resulta útil cuando hijas de hembras de alto valor genético son incluidas en programas de descarte debido a una carga alta por unidad de explotación dentro del hato o estas últimas pierden prematuramente la capacidad de gestar por afecciones patológicas no ováricas y son destinadas al matadero. Desde el punto de vista investigativo y experimental, el contar con ovocitos criopreservados es una fuente excelente de material biológico para el desarrollo y mejoramiento de nuevas TRA, en especial la FIV y la conservación de especies en vías de extinción.
En lo que hace relación a la recolección de ovocitos, cultivo, maduración y fertilización in vitro, me permito referirlos al capítulo FERTILIZACION IN VITRO de este mismo BLOG, por lo que solo trataremos acá lo correspondiente a las técnicas de criopreservacion de ovocitos utilizadas actualmente y los resultados obtenidos, los cuales han sido muy variables.
Las técnicas de criopreservación son similares a las empleadas en la criopreservación de embriones, con algunas variaciones en cuanto al estado de desarrollo más adecuado del ovocito, calidad de las envolturas que lo rodean, apariencia del citoplasma y el núcleo, los cuales son indicadores del potencial de maduración y fertilización in vitro, así como el tipo de soluciones y tiempos empleados en cada una de estas técnicas..
Los ovocitos de calidad A tienen un mayor porcentaje de maduración con respecto a los de calidad B y C. Igualmente presentaron un porcentaje menor de degeneración. Por lo tanto, cuando los ovocitos con envolturas intactas y con mayor número de capas del cúmulo ooforo tienen un porcentaje mayor de maduración, con relación a los que tienen pocas capas o estaban denudados. Luego de la descongelación y cultivo por 2 horas el porcentaje de degeneración es mayor en la vitrificación vs congelación lenta, sin embargo la supervivencia es mayor en la congelación lenta que en la vitrificación. (ZARATE 2006)
Otro estudio muestra que por el método lento la supervivencia de los ovocitos fue del 54% y de los vitrificados fue del 90% (MAVRIDES 2002), Así mismo otros reportan que el 60% de los ovocitos desvitrificados conservan sus estructuras morfológicas intactas (DIEZ 2005), otros reportan que la conservación es del 79% para vitrificados mediante CPS y 63% para OPS, 39% en EMG y 77% en pajillas normales.
ALABARRACIN 2005 reportó un porcentaje de fertilización del 27.5% en ovocitos vitrificados mediante OPS y del 67% para ovocitos congelados en fresco, con porcentajes de división del 29.8% para los vitrificados vs 57% de los no vitrificados, con un desarrollo hasta el estado de blastocisto de 4.8% para los vitrificados y 27% para los no vitrificados
HAJARIAN et al 2011 compararon la vitrificación de ovocitos bovinos inmaduros en dispositivos OPS, EMG, Cryotop y control con el fin de unificar el empleo de los mismos, buscando un mayor porcentaje de enfriamiento/calentamiento, mejor protección y mayor viabilidad después del calentamiento. Los ovocitos inmaduros fueron evaluados de acuerdo a la existencia de CP y las características del núcleo después de la maduración.
La evaluación de los Cuerpos Polares de ovocitos denudados muestran que la vitrificación con Cryotop aumenta el porcentaje de ovocitos con CP extruido, sin embargo fue más baja que la del grupo de ovocitos en fresco o control. La degeneración fué mayor en el grupo OPS siendo mínima en el control seguida por el grupo Cryotop. No hubo diferencia significativa en cuanto a la ausencia de CP entre los grupos de vitrificación siendo el porcentaje más bajo el del grupo control.
Luego de la vitrificación/calentamiento de los oocitos inmaduros el grupo Cryotop presentó un estado de MII del 58%, significativamente mayor en comparación con el grupo EMG 46% y OPS 35%. Los oocitos de los grupos Cryotop y EMG en su proceso de maduración tuvieron menos vesículas germinales (GV) en comparación con al grupo OPS. No hubo diferencia significativa en el porcentaje de GVBD-MI entre todos los grupos. En comparación con los otros grupos el porcentaje de GV y GVBD-MI resultante fue mínimo para el grupo control.
La viabilidad de los ovocitos del grupo Cryotop 90% y EMG 89% fue significativamente más alta en comparación con el 79% del grupo OPS, sin embargo el grupo control presentó el 100%, siendo significativamente mayor al de los grupos tratados.
El porcentaje de clivaje fue mayor para el grupo Cryotop (40.21±4.21%) al compararlo con el grupo EMG 33.29±1.35 y 30.94±1.61 del grupo OPS no habiendo diferencia significativa entre estos dos grupos.
El porcentaje de desarrollo de los embriones a 8 células o más fue significativamente mayor en el grupo Cryotop (23.33±1.62) que en el grupo OPS 17.15±3.22% y del 12.91±2.00% del grupo EMG.
Los porcentajes de maduración nuclear de ovocitos vitrificados en dispositivos Cryotop fueron mayores a los otros dispositivos, demostrando la capacidad de los ovocitos para sobrevivir a la vitrificación. La maduración de los ovocitos inmaduros vitrificados fué comparablemente más baja a los reportes de otros estudios.
El porcentaje de clivaje de los ovocitos y embriones de ±8 células fueron mayores con Cryotop, seguido de EMG, por lo que este parece que preserva mejor la estructura celular y en consecuencia la capacidad de fertilización de los ovocitos inmaduros vitrificados. Sin embargo, estos resultados fueron significativamente más bajos que los ovocitos inmaduros en fresco del grupo control. Esta reducción del clivaje con EMG puede deberse al manejo dado durante el calentamiento, por lo que los resultados deben tomarse con precaución
Aunque el porcentaje de blastocistos no presentó diferencia significativa, el Cryotop tuvo un mayor porcentaje de blastocistos y demostró su superioridad sobre los otros dos dispositivos. Sin embargo, al comparar la formación de blastocistos entre los tratados y en fresco, se observa que el daño resultante de la vitrificación pueden comprometer la viabilidad y posterior desarrollo de los ovocitos inmaduros vitrificados.
https://www.youtube.com/watch?v=gJcjdGMkhOY
MATERIALES Y EQUIPO
- Vial Medios de Vitrificación.
- Sol. Equilibrio1x1.5ml SE
- Sol. Vitrificación1x1.5 ml SV1
- Sol. Vitrificación 1x1.5 ml SV2
- "Cryotop ®"
- "Cryotop ®" SC
- Placa de 6 Pozos
- Termo de Enfriamiento
- Pipeta Pasteur
- Micropipetas 2 - 20 µl
- Reloj Temporizador
- Pinzas
- Tijeras o Corta pajillas
- Bloque de Aluminio
- Sellador
- Termo de Almacenamiento
- Nitrógeno Líquido
- Cámara de Flujo Laminar bajo la cual se desarrollaran los diferentes procesos.
FASE DE PREPARACION
2.- Identifique y marque el número del embrión en la funda de la pajilla.Monte el "Cryotop"
3.- Introduzca el "Cryotop" en la funda.
4.- Coloque el soporte de aluminio dentro del termo de refrigerador desde el principio
5.- Llene con nitrógeno líquido hasta cubrir la parte superior del soporte de aluminio.
6.- Retire de la incubadora la caja de Petri que contiene los embriones en solución de cultivo.
FASE DE EQUILIBRIO
7.- Marque con SE -SV1 -SV2 la tapa de la placa de seis pozos.
Agite cada vial de las soluciones para homogenizar.
8.- Con la micropipeta deposite 300 µl de cada solución según corresponda e inmediatamente tape la placa
9 Revise el reloj temporizador para los pasos siguientes.
10.- Aspire el embrión en la punta de la pipeta Pasteur con un mínimo de medio y deposítelo en el fondo del pozo con SE.
El embrión desciende libremente a los 30 segundos.
El embrión comienza a encogerse y luego gradualmente retorna a su tamaño original con la penetración de la solución SE, lo cual indica que la Fase de Equilibrio se ha completado.
El tiempo de equilibrio recomendado para cada tipo de células es de:
- OOCITO 12 - 15 Min.
- 2 - 4 -8 CELULAS 10 - 15 Min
- MORULA O BLASTOCISTO 12 - 15 Min
Se recomienda para el equilibrio Blastocistos en el día 5
FASE DE VITRIFICACION
11.- Luego de completar la Fase de Equilibrio, aspire el embrión de la SE en la punta de la pipeta.
12.- Transfiera el embrión con un volumen mínimo de SE en el centro del pozo 2 con SV1. Deposite solamente el embrión.
13.- Expulse fuera del pozo la cantidad restante de SE dentro de la pipeta.
14.- Aspire SV1 fresco y expúlselo fuera del pozo.
Aspire SV1 fresco dentro de la micropipeta.
Revuelva rápidamente alrededor del embrión.
16.-Repita la aspiración-expulsión por tres veces y revuelva.
17.- Cambie cada vez la posición del embrión dentro de SV1.
Mueva la solución alrededor del embrión hasta que solamente permanezca la SV1 y visualmente desparezca la SE
18.- Expulse el SV1 restante en la micropipeta y bótelo fuera del pozo.
19.- Aspire SV2 fresco dentro de la micropipeta
20.- Aspire el embrión en SV1 en la punta de la micropipeta
21.- Transfiera el embrión a SV2 con un volumen mínimo de SV1. Revuelva alrededor del embrión.
22.- Cambie de lugar el embrión por dos veces con la micropipeta en SV2.
Este paso se completa cuando el embrión queda libre de SV1 en el tercer pozo y solamente se observa SV2. El embrión se ve encogido debido a la deshidratación.
23.- Retire el Cryotop de la funda. Sumerja la funda en el nitrógeno liquido.24.- Aspire el embrión en SV2 en la punta de la micropipeta.
Deposite el embrión en la lámina del Cryotop por la parte de la marca negra, con un mínimo volumen de SV2 (< 0.1 µl).
Luego de depositar el embrión en la lámina remueva el exceso de SV2 utilizando la micropipeta para aspirar. Cuando hay varios embriones, haga una gota para cada uno de ellos.
25.- Sumerja el Cryotop directamente en el nitrógeno líquido.
26.- Sostenga la funda llena de nitrógeno líquido con las pinzas e inserte el Cryotop por el extremo laminar dentro de la funda.
27.- Fije el Cryotop girándolo con ambas manos en sentido contrario de la funda.
Mantenga el Cryotop montado dentro del nitrógeno líquido hasta que se transfiera al termo de almacenamiento.
No exponer al aire el Cryotop hasta la fase de descongelación.
"CRYOTOP" SC ®
28.- Sumerja la funda del Cryotop directamente en el nitrógeno líquido, sin llenarla.
Corte la funda del Cryotop a nivel de la marca negra.
29.- Inserte el Cryotop con el embrión dentro de la funda sin nitrógeno líquido dentro de ella.
30.- Selle la funda del Cryotop.
Al sellar tenga cuidado de no introducir nitrógeno líquido dentro de ella.
La temperatura se mantiene a -15°C a una altura de 2.5 cm por encima de la superficie del nitrógeno líquido.
31.- Para identificar la superficie del nitrógeno líquido observe la marca negra de la funda del Cryotop.
Precaución: Mantenga la funda del Cryotop dentro del nitrógeno líquido hasta que se transfiera a un termo de almacenamiento
"CRYOTOP" STC ®(Sistema Totalmente Cerrado). Consiste en insertar el Cryotop SC® sellado, sin entrar en contacto con el nitrógeno líquido, dentro de una segunda funda y sellarla nuevamente.
FASE DE CALENTAMIENTO
MATERIALES Y EQUIPO
VIAL DE MEDIOS - Solución de Calentamiento ST 2x4 ml
- Solución Diluyente DS 1x4 ml
- Solución Lavado WS 1x4 ml
- Placa de 6 Pozos
- Caja de Petri x 2
- Termo Refrigerador
- Pipeta Pasteur
- Micropipetas 10 y 1000 µl
- Reloj Temporizador
-
32.- Caliente en la incubadora a 37°C el vial de TS en una Caja de Petri durante 1.5 Hs, con al menos 90 min antes del procesoLas Soluciones DS y WS se mantienen a temperatura ambiente (25-27°C)Retire del Termo de Almacenamiento la canastilla que contiene el “CRYOTOP ®” correspondiente y deposítelo en el termo de enfriamiento con nitrógeno líquido.
Revise la etiqueta de identificación del “CRYOTOP ®”
Marque con DS, W y WS la Placa de 6 pozos. Agite suavemente los frascos de solución para homogenizar.
Deposite en cada pozo 300 µl de la solución correspondiente, según el caso.
33.- Retire de la incubadora el vial de TS y la caja de Petri y colóquelos cerca al microscopio. Agite suavemente los viales para homogenizar. Ajuste el foco del microscopio para observar el fondo de la caja de Petri con TS.
Revise el funcionamiento del reloj temporizador y colóquelo en 0.
Retire suavemente la funda del “CRYOTOP®” y colóquelo en la esquina del termo refrigerador, sin sacarlo del nitrógeno líquido.
35.- Retire el “CRYOTOP®” y sumérjalo rápidamente dentro de la caja de Petri con TS. Debe permanecer dentro 1 segundo.
37.- Un minuto después de sumergido el “CRYOTOP®” en TS, y que el embrión quede libre de la lámina, déjelo durante 3 minutos. Esto para que se reemplace gradualmente de TS a DS.
Con la pipeta Pasteur aspire suavemente el embrión. Al mismo tiempo aspire TS hasta que el embrión quede a 2 mm de la punta de la pipeta Pasteur.
38.- Deposite un poco de TS en el fondo de la SD junto con el embrión.
Déjelo durante 5 minutos.
Luego aspire DS hasta que el embrión quede a 2 mm de la punta de la pipeta.
39.- Transfiera el embrión al fondo del pozo que contiene WS1 y deposítelo con un volumen mínimo de DS.Déjelo durante 5 minutos.
40.- Aspire el embrión con la punta de la pipeta junto con un volumen mínimo de WS1 y transfieralo al centro de la superficie del pozo que contiene WS2.
Cuando el embrión desciende al fondo del pozo con WS2, repita una vez más el paso anterior en WS2.
41.- Transfiera el embrión a una placa de cultivo que contenga el medio apropiado. Incube el embrión (es) a 37°C hasta completar su restitución al estado inicial. Se recomiendan 2 Hs de incubación.
Una vez restituido el embrión (es) aspírelo en una pajilla de 0.25 ml para ser transferido inmediatamente.
Los resultados presentados en los diferentes estudios muestra su gran variabilidad, lo que confirma una vez más la importancia que tiene el conocimiento de las bases fisiológicas reproductivas, la capacidad y destreza del Profesional que realiza los distintos procedimientos en cada una de las técnicas expuesta, así como también la importancia que tiene la calidad y confiabilidad de los medios utilizados en las mismas.Lo anterior demuestra una vez más la gran variación existente entre las diferentes técnicas de criopreservación
CRIOPRESERVACION DE OVOCITOS
El ovocito es la célula más grande del organismo. Un ovocito maduro se caracteriza por su forma esférica, presentar el primer cuerpo polar en el espacio perivitelino y encontrarse en un estado de desarrollo de Metafase II, los cromosomas y el huso están libres en el citoplasma y las vesículas y los gránulos corticales están próximos a la membrana plasmática, rodeados por varias capas del Complejo Cúmulo Ooforo CCO, permaneciendo en este estado hasta que es fertilizado, momento en el cual se completa la meiosis y se forman los pronúcleos.
La criopreservación de ovocitos bovinos para su posterior fertilización in vitro es una TRA que resulta útil cuando hijas de hembras de alto valor genético son incluidas en programas de descarte debido a una carga alta por unidad de explotación dentro del hato o estas últimas pierden prematuramente la capacidad de gestar por afecciones patológicas no ováricas y son destinadas al matadero. Desde el punto de vista investigativo y experimental, el contar con ovocitos criopreservados es una fuente excelente de material biológico para el desarrollo y mejoramiento de nuevas TRA, en especial la FIV y la conservación de especies en vías de extinción.
En lo que hace relación a la recolección de ovocitos, cultivo, maduración y fertilización in vitro, me permito referirlos al capítulo FERTILIZACION IN VITRO de este mismo BLOG, por lo que solo trataremos acá lo correspondiente a las técnicas de criopreservacion de ovocitos utilizadas actualmente y los resultados obtenidos, los cuales han sido muy variables.
Las técnicas de criopreservación son similares a las empleadas en la criopreservación de embriones, con algunas variaciones en cuanto al estado de desarrollo más adecuado del ovocito, calidad de las envolturas que lo rodean, apariencia del citoplasma y el núcleo, los cuales son indicadores del potencial de maduración y fertilización in vitro, así como el tipo de soluciones y tiempos empleados en cada una de estas técnicas..
Los ovocitos de calidad A tienen un mayor porcentaje de maduración con respecto a los de calidad B y C. Igualmente presentaron un porcentaje menor de degeneración. Por lo tanto, cuando los ovocitos con envolturas intactas y con mayor número de capas del cúmulo ooforo tienen un porcentaje mayor de maduración, con relación a los que tienen pocas capas o estaban denudados. Luego de la descongelación y cultivo por 2 horas el porcentaje de degeneración es mayor en la vitrificación vs congelación lenta, sin embargo la supervivencia es mayor en la congelación lenta que en la vitrificación. (ZARATE 2006)
Otro estudio muestra que por el método lento la supervivencia de los ovocitos fue del 54% y de los vitrificados fue del 90% (MAVRIDES 2002), Así mismo otros reportan que el 60% de los ovocitos desvitrificados conservan sus estructuras morfológicas intactas (DIEZ 2005), otros reportan que la conservación es del 79% para vitrificados mediante CPS y 63% para OPS, 39% en EMG y 77% en pajillas normales.
ALABARRACIN 2005 reportó un porcentaje de fertilización del 27.5% en ovocitos vitrificados mediante OPS y del 67% para ovocitos congelados en fresco, con porcentajes de división del 29.8% para los vitrificados vs 57% de los no vitrificados, con un desarrollo hasta el estado de blastocisto de 4.8% para los vitrificados y 27% para los no vitrificados
HAJARIAN et al 2011 compararon la vitrificación de ovocitos bovinos inmaduros en dispositivos OPS, EMG, Cryotop y control con el fin de unificar el empleo de los mismos, buscando un mayor porcentaje de enfriamiento/calentamiento, mejor protección y mayor viabilidad después del calentamiento. Los ovocitos inmaduros fueron evaluados de acuerdo a la existencia de CP y las características del núcleo después de la maduración.
La evaluación de los Cuerpos Polares de ovocitos denudados muestran que la vitrificación con Cryotop aumenta el porcentaje de ovocitos con CP extruido, sin embargo fue más baja que la del grupo de ovocitos en fresco o control. La degeneración fué mayor en el grupo OPS siendo mínima en el control seguida por el grupo Cryotop. No hubo diferencia significativa en cuanto a la ausencia de CP entre los grupos de vitrificación siendo el porcentaje más bajo el del grupo control.
El porcentaje de clivaje fue mayor para el grupo Cryotop (40.21±4.21%) al compararlo con el grupo EMG 33.29±1.35 y 30.94±1.61 del grupo OPS no habiendo diferencia significativa entre estos dos grupos.
El porcentaje de desarrollo de los embriones a 8 células o más fue significativamente mayor en el grupo Cryotop (23.33±1.62) que en el grupo OPS 17.15±3.22% y del 12.91±2.00% del grupo EMG.
Los porcentajes de maduración nuclear de ovocitos vitrificados en dispositivos Cryotop fueron mayores a los otros dispositivos, demostrando la capacidad de los ovocitos para sobrevivir a la vitrificación. La maduración de los ovocitos inmaduros vitrificados fué comparablemente más baja a los reportes de otros estudios.
El porcentaje de clivaje de los ovocitos y embriones de ±8 células fueron mayores con Cryotop, seguido de EMG, por lo que este parece que preserva mejor la estructura celular y en consecuencia la capacidad de fertilización de los ovocitos inmaduros vitrificados. Sin embargo, estos resultados fueron significativamente más bajos que los ovocitos inmaduros en fresco del grupo control. Esta reducción del clivaje con EMG puede deberse al manejo dado durante el calentamiento, por lo que los resultados deben tomarse con precaución
Aunque el porcentaje de blastocistos no presentó diferencia significativa, el Cryotop tuvo un mayor porcentaje de blastocistos y demostró su superioridad sobre los otros dos dispositivos. Sin embargo, al comparar la formación de blastocistos entre los tratados y en fresco, se observa que el daño resultante de la vitrificación pueden comprometer la viabilidad y posterior desarrollo de los ovocitos inmaduros vitrificados.
https://www.youtube.com/watch?v=gJcjdGMkhOY
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ZARATE O. COMPARACION DE DOS METODOS DE CRIOPRESERVACION DE OVOCITOS BOVINOS. tesis de Grado Facultad de Medicina Veeterinaria y Zootecnia Universidad veracruzana 2006
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