La predeterminación del sexo
en bovinos es uno de los objetivos afanosamente buscado por los investigadores
en Reproducción Asistida y su aplicación comercial en la producción y
productividad de las explotaciones ganaderas, ya sea mediante Inseminación
Artificial o en Fertilización In Vitro.
El objetivo es conseguir el
mayor número de nacimientos de hembras para la producción de leche, de machos
en la explotación de carne o la producción de reproductores de reemplazo en
ganaderías puras.
Para la Industria lechera, la tecnología
del semen sexado aumenta la posibilidad de tener una hembra de un 50%
con semen convencional a un 90% cuando se utiliza semen sexado. Aumentar el
número de becerras nacidas en la lechería, le permite al productor tener una
expansión rápida de su hato.
Desde 2006 el empleo de semen sexado se ha incrementado ampliamente y este aumento se debe en gran parte al empleo de la PEFIV, siendo una de las más ventajosas combinaciones de la biotecnología reproductiva. El semen sexado ha ganado cada día más espacio hasta el punto de convertirse en un proceso indispensable para los que desean obtener una alta producción y rendimiento económico. (BUTLER 2014)
Desde 2006 el empleo de semen sexado se ha incrementado ampliamente y este aumento se debe en gran parte al empleo de la PEFIV, siendo una de las más ventajosas combinaciones de la biotecnología reproductiva. El semen sexado ha ganado cada día más espacio hasta el punto de convertirse en un proceso indispensable para los que desean obtener una alta producción y rendimiento económico. (BUTLER 2014)
A pesar de los grandes avances técnicos alcanzados, el porcentaje de animales preñados es menor con semen sexado que con semen convencional. La fertilidad en ganado vacuno puede estar condicionada por diversos factores cuando utilizamos semen sexado. A su vez, el menor número de espermatozoides de la dosis y la fertilidad asociada a un toro determinado, pueden reducir las tasas de concepción de la explotación.
Un trabajo presentado en 2013 realizado en Canadá con novillas de 14 a 16 meses de edad, comparó la fertilidad obtenida mediante inseminaciones con semen sexado y semen convencional tras celos naturales e Inseminación A Tiempo Fijo (IATF) con un protocolo de 5 días y un dispositivo intravaginal de progesterona (PRID). La tasa de concepción en los animales inseminados fué del 73% vs 67% con celo natural y de 66 y 59% con IATF, con semen convencional y sexado, respectivamente. Como conclusión, la fertilidad con semen sexado fue un 8-11 % más baja respecto al
semen convencional, aun así, hay que tener en cuenta que en este estudio,
realizado en una situación de alta fertilidad, aunque la IA con celo natural
permitió obtener una mejor tasa de concepción, las novillas sometidas a IATF
con semen sexado tuvieron una tasa de concepción aceptable.
Aunque la IA con celo natural permitió obtener una mejor tasa de concepción, las novillas sometidas a IATF con semen sexado tuvieron una tasa de concepción aceptable (COLAZO)
Aunque la IA con celo natural permitió obtener una mejor tasa de concepción, las novillas sometidas a IATF con semen sexado tuvieron una tasa de concepción aceptable (COLAZO)
Hay que tener en cuenta que la formación del reservorio espermático a nivel del oviducto ayuda al mantenimiento de la viabilidad espermática y la sincronización de la ovulación en el tracto reproductivo femenino, el cual es dependiente de la presencia de proteinas y azúcares en la membrana espermática. Debido a la alteración de estos perfiles en la cabeza de espermatozoides sexados se explica la baja fertilidad obtenida con el empleo del mismo, ya que el espermatozoide sexado permanece menos tiempo unido a la pared del reservorio.
La información anterior conduce a sugerir que el mejor momento para inseminar utilizando semen sexado debe ser lo más cerca posible al momento de la ovulación. Esta demora en el momento de la IA reduce el tiempo de espera del esperma en el tracto reproductivo femenino, asegurando un mayor número de células viables al momento de la ovulación. (CARVALHO 2014)
La Asociación de Criadores Ayrshire de Colombia informó que con el uso de la técnica de semen sexado, las vacas pueden parir terneras en el 85 y el 90% de los casos, frente a un 48% con el uso de pajillas convencionales (JUNGUITO)
Por el contrario, al comparar las tasa de no retorno logradas con dosis de esperma 2 x 106 de semen sexado y semen convencional con las obtenidas con dosis de 10 x 106 procesado convencionalmente, implica que una parte de la disminución de la tasa de concepción de semen sexado es inducida por el colorante y/o el proceso en sí mismo y puede no ser compensada mediante el aumento de la dosis de semen. (De JARNETTE 2011).
Por el contrario, al comparar las tasa de no retorno logradas con dosis de esperma 2 x 106 de semen sexado y semen convencional con las obtenidas con dosis de 10 x 106 procesado convencionalmente, implica que una parte de la disminución de la tasa de concepción de semen sexado es inducida por el colorante y/o el proceso en sí mismo y puede no ser compensada mediante el aumento de la dosis de semen. (De JARNETTE 2011).
De acuerdo a los resultados obtenidos en varias investigaciones, se alcanzaron tasas de concepción del 75 al 80% con dosis de esperma de 2.1 × 106 en novillas Holstein en comparación con las logradas con semen convencional. (SCHENK)
Con posterioridad se observó una mejoría marginal en las tasas de concepción de algunos reproductores luego de IA con semen sexado a dosis de 3.5 a
5.0 × 106, y 10 x 106 ,lo cual sugiere que puede compensarse al menos una parte de la disminución de las tasas de concepción con semen sexado
El proceso de sexaje induce daños en el esperma, debido a la exposición al laser, la alta velocidad dentro del tubo colector, los cambios eléctricos y la temperatura ambiente antes de iniciar el proceso. Considerando que el semen es sometido a una gran variedad de condiciones adversas, es necesario efectuar una evaluación estructural y funcional de estos daños durante el proceso de sexaje, la cual se efectúa por el sistema CASA.
El análisis de la motilidad es una de las características más importantes del semen para el mantenimiento de la fertilidad, por lo que su evaluación tanto subjetiva como por análisis computarizado es esencial en cualquier valoración espermática. Carvalho 2009 encontró una baja velocidad, frecuencia y motilidad lineal, lo cual puede deberse a la exposición al láser, el colorante o los cambios electricos.
Además de la motilidad, se han evaluado otros factores como los cambios en el ADN.
Varios estudios han demostrado que el sexado no afecta la integridad del ADN espermático debido a la alta cantidad de protamina (histona) presente en el semen bovino. (GOSALVES 2011)
Otra característica física que puede estar afectada es la integridad de la membrana plasmática. Varios estudios han demostrado que el proceso de sexaje incrementa el porcentaje de membranas plasmáticas lesionadas. (VILLAMIL 2012)
Esta alteración de la membrana va acompañada de cambios en la morfología de la cabeza del espermatozoide. El espermatozoide no sexado presenta una mayor altura, elongación y desigualdad en su superficie, siendo menor su circularidad en comparación con el sexado. Estas modificaciones en conjunto hacen que el espermatozoide disminuya su período de supervivencia en el tracto reproductivo de la hembra. (CARVALHO 2014)
Aunque varios estudios han evaluado el efecto del proceso de sexado en cuanto a sus características estructurales y funcionales, la causa real de la baja fertilidad de este esperma, en especial cuando se emplea in vivo no ha sido identificada de manera clara, por lo que se considera que esta baja fertilidad tiene causas multifactoriales. (CARVALHO 2014)
Adicionalmente es importante indicar que el proceso ha mejorado por la introducción de ciertas modificaciones como la disminución de la carga de sexaje y el uso de colorantes para excluir los espermatozoides muertos. Estos cambios hacen el proceso más eficiente y menos lesivo para el esperma. (CARVALHO 2010)
Por lo general, los cambios en los protocolos FIV, así como la preparación del esperma y el tiempo de coincubación entre el esperma y el ovocito, se han utilizado para incrementar el porcentaje de blastocistos cuando se usa semen sexado.. Sin embargo, la tasa reducida de fertilidad después de la IA o Tendencias entre las condiciones necesarias para la fertilización, se constituye en un problema para el empleo de semen sexado in vivo. Los resultados asociados a las diferencias entre las condiciones necesarias para fertilización sugiere que el proceso de sexado compromete los parámetros que, aunque no son importantes en la fertilización in vitro, pueden ser esenciales para le fertilización in vivo.
De otra parte, el tiempo de supervivencia en el tracto reproductivo puede ser lo más notable, ya que el esperma permanece viable después de las 30 horas de la descongelación. En un estudio CARVALHO 2013 mostró que el proceso de sexado tiene un efecto negativo sobre la motilidad, potencial de la membrana mitocondrial y la integridad de la membrana plasmática y acrosomal
Algunos estudios han documentado que el desarrollo del embrión se ve comprometido después de la IA con semen sexado lo que tienden a sustentar esta hipótesis. (SARTORI, POTTER, LARSON)
El proceso de separación celular lesiona el esperma física y fisiológicamente, lo cual compromete la fertilidad resultante, en comparación con semen procesado convencionalmente, cuando se emplea en IA e iVF. (HAYAKAWA)
CITOMETRIA
DE FLUJO
En la actualidad para el sexado de
espermatozoides se emplea principalmente la técnica de Citometría de Flujo.
Por primera vez fue reportada la
identificación de los cromosomas X o Y de
la población de espermatozides mediante la utilización de la Citometría de
Flujo por GARNER et al 1983, posteriormente fue validada por JOHNSON et al en
1989, con el nacimiento de una cría de sexo predeterminado. Las últimas investigaciones documentan la capacidad de la Citometría de Flujo en lograr la producción de un 90% de crías en bovinos. Sin embargo por su
naturaleza invasiva del proceso de separación sexual produce efectos negativos
sobre la viabilidad y calidad del esperma. (SEIDEL).
Esta técnica se basa en las
características propias del ADN espermático y su contenido en los cromosomas. La cadena cromosómica “X” de la hembra tiene 3.8% más ADN que la cadena “Y” del macho en bovinos, siendo por consiguiente más grande.
Es el espermatozoide el que
siempre determinará el sexo de una cría. El caso es que el espermatozoide puede
contener o un cromosoma “X” o uno “Y”; por su parte el óvulo siempre poseerá un
cromosoma “X”. Por tanto, para que se produzca una hembra (XX) un
espermatozoide “X” debe fertilizar el óvulo. Por el contrario, si fuera un espermatozoide con cromosoma “Y” el que lo
fertiliza, se producirá un macho (XY). La mitad de los espermatozoides en un
eyaculado portan el cromosoma X y la otra mitad el cromosoma Y, por lo tanto en un lote de vacas los nacimientos de
crías machos o hembras se distribuye en un 50% de cada sexo.
Esa diferencia hace que las células espermáticas puedan ser separadas de manera que haya predominio de hembras o machos, para ser empleadas en IA, TE o FIV.
La calidad y concentración espermática
de los eyaculados son quizás los factores más importantes para obtener una
buena separación de las dos poblaciones espermáticas. Así lo demuestran
resultados que indican una alta correlación entre la motilidad espermática, la
concentración y la separación de las poblaciones en un citómetro de flujo de
alta velocidad. Por ende, la separación de espermatozoides X e Y se lleva a
cabo normalmente en eyaculados con más del 50% de espermatozoides con motilidad
progresiva y 75% de espermatozoides normales. (SCHENK)
Consiste en la incubación del semen con un colorante (Hoechst 33342), que se adhiere al ADN del espermatozoide produciendo diferentes longitudes de onda, las cuales emiten fluorescencia cuando son sometidos a una luz láser ultravioleta. Como el espermatozoide X” contiene más ADN, este atrapa más colorante, por lo que es más brillante.
Para poder detectar la diferencia fluorescencia y separar los deseados, se utiliza un citómetro de flujo. El mismo consiste en un circuito cerrado de alta velocidad de flujo de líquidos que permite alinear y "leer" los espermatozoides de manera individual en microgotas.
Una vez que el semen entra en el citómetro es succionado por una bomba de vacío y registrado por diferentes lentes que le dan orientación, previa marcación de las células por el colorante.
- Un cristal piezoelectrico ondula y quiebra la corriente en gotículas -90,000/segundo.
- Un rayo láser proyecta luz azul sobre los espermatozoides con una longitud de onda específica de acuerdo al contenido de ADN de la célula.
- Los espermatozoides "X" poseen una fluorescencia 4% mayor que la intensidad de los "Y".
- La computadora procesa la fluorescencia detectada y categoriza los espermatozoides como "X" , "Y" o dudosos.
- Se aplica una carga negativa, positiva o ninguna a las gotículas.
- Las gotículas cargadas son desviadas cuando pasan frente a placas cargadas continuamente. Las de carga positiva son atraídas al lado negativo y las de carga negativa lo son al lado positivo.
- Los espermatozoides seleccionados son recogidos en tres recipientes.
- Conjuntamente se adiciona otro colorante, el Yoduro de Propidio (PI) que permite identificar los espermatozoides muertos o dañados y separarlos sin carga eléctrica de los espermatozoides sexados viables en un recipiente independiente (GARNER)
Del total
de muestra obtenida en el eyaculado inicial aproximadamente 20% de los
espermatozoides es colectado en la fracción X, 20% en la fracción Y mientras
que el 60% restante lo constituyen espermatozoides que no pudieron ser
detectados por la técnica. La dosis de semen sexado contiene en promedio un 90%
de espermatozoides del sexo deseado, además de no contener espermatozoides
muertos o dañados pues son separados durante el proceso de sexado. (RAMOS 2013)
Una vez separados los espermatozoides,
el semen fresco debe utilizarse dentro de las 24 horas siguientes o son
congelados para su utilización posterior.
La diferencia de esta técnica de citometría de flujo con otras técnicas radica en:
- Excelente velocidad (miles de células por segundo, contra el conteo manual)
- Excelente precisión
- Inocuidad con las células sometidas o con materiales biológicos (la viabilidad celular No cambia, ni su función) al ser procesadas por la máquina
- Posibilidad de tomar varios parámetros o medidas de una célula al mismo tiempo. (BARRERO)
Las características del semen luego del sexado deben estar entre:
La fertilidad en el ganado bovino está condicionada por diversos factores cuando se utiliza semen sexado, ya que tiene un tiempo de supervivencia menor en el útero que las dosis convencionales, alterando el intervalo óptimo para inseminar el animal en relación con el momento de la ovulación. A su vez, el menor número de espermatozoides de la dosis y la fertilidad asociada a un toro determinado, hace que se reduzca la tasa de concepción de la explotación. En consecuencia si se tienen en cuenta algunas variables como la expresión o no del celo, el momento de la inseminación adaptado al menor período de vida del semen sexado y el porcentaje de preñez obtenido, se está más cerca de utilizar más ampliamente y de manera programada el semen sexado.
- Motilidad progresiva superior al 45%
- Acrosomas intactos a las 3 horas de incubación del 50%
- Recuento de espermatozoides por pajilla 3 X106
- Menos de 25% de colonias de bacterias por muestra.
- Mínimo 87% de selección de sexo. (BARRERO)
La fertilidad en el ganado bovino está condicionada por diversos factores cuando se utiliza semen sexado, ya que tiene un tiempo de supervivencia menor en el útero que las dosis convencionales, alterando el intervalo óptimo para inseminar el animal en relación con el momento de la ovulación. A su vez, el menor número de espermatozoides de la dosis y la fertilidad asociada a un toro determinado, hace que se reduzca la tasa de concepción de la explotación. En consecuencia si se tienen en cuenta algunas variables como la expresión o no del celo, el momento de la inseminación adaptado al menor período de vida del semen sexado y el porcentaje de preñez obtenido, se está más cerca de utilizar más ampliamente y de manera programada el semen sexado.
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